：自所述靶标基因的5'末端 核苷酸起，向上游方向延至80bp处(记为A点），向下游方向延至80bp处(记为B点）；在所述出 发质粒上自所述所述A点起至所述B点止，且包含所述靶标基因的片段即为所述靶标基因的 起始区域；
[0030] 所述靶标基因的终止区域为：自所述靶标基因的3'末端核苷酸起，向下游方向延 至80bp处(记为C点），向上游方向延至80bp处(记为D点）；在所述出发质粒上自所述C点起至 所述D点止，且包含所述靶标基因的片段即为所述靶标基因的终止区域；
[0031] 所述靶标基因的起始区域位于所述靶标基因的终止区域的上游。
[0032]在所述方法中，所述出发质粒具体可为全长10_50kb的环形质粒(如30_40kb，具体 如34.8kb)。所述上游同源臂和所述下游同源臂的长度具体可为15-80bp(如20-40bp)。步骤 (e)中，进行所述同源重组的方法具体可为Gibson连接法。
[0033]在所述方法中，设计所述上游同源臂和所述下游同源臂时需考虑对所述出发质粒 进行改造时是否会产生移码突变的问题。在所述方法中，由于所述靶序列的选择所产生的 改造位点的偏差可以通过后面设计同源臂的步骤进行弥补。
[0034]所述方法在改造腺病毒载体中的应用也属于本发明的保护范围。
[0035] 在所述应用中，所述腺病毒载体可为5型腺病毒载体pAD/PL-DEST;所述靶标基因 为5型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因；所述目的基因为35型腺病毒纤毛头节和杆区的 编码基因。
[0036] 更加具体的，所述5型腺病毒载体pAD/PL-DEST具体为Invitrogen公司生产的pAd/ PL-DEST Gateway Vector Kit中的产品，货号为V494-20。所述5型腺病毒纤毛头节和杆区 的编码基因的核苷酸序列为GenBank:M18369.1 (Update : 1993-4-27)所示序列的第608-2218位;所述35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因为GenBank: U10272.1 (Update: 1995-5-12)所示序列的第130-969位。
[0037]本发明具体提供了一种基于上述方法构建Ad5F35嵌合型腺病毒载体的方法。
[0038]本发明所提供的构建Ad5F35嵌合型腺病毒载体的方法，具体可包括如下步骤： [0039] (1)采用Cas9蛋白、向导RNA1和向导RNA2切割5型腺病毒载体pAD/PL-DEST，回收所 述5型腺病毒载体pAD/PL-DEST的骨架大片段;所述向导RNA1为序列表中序列7所示的单链 RNA;所述向导RNA2为序列表中序列8所示的单链RNA;
[0040] 其中，所述5型腺病毒载体pAD/PL-DEST具体为Invitrogen公司生产的pAd/PL-DEST Gateway Vector Kit中的产品，货号为V494-20。
[0041] 所述向导RNA1和所述向导RNA2分别依次特异于所述5型腺病毒纤毛头节和杆区的 编码基因的起始区域和终止区域。所述向导RNA1针对的靶序列1为GenBank:M18369.1 (Update: 1993-4-27)所示序列的第626-607位;所述向导RNA2针对的靶序列2为GenBank: M18369.1(Update: 1993-4-27)所示序列的第2234-2215位（因为是CCN PAM所以靶序列的位 置是从高位到低位进行标注的）。
[0042] 进行所述切割时，所述Cas9蛋白、所述向导RNA1、所述向导RNA2和所述5型腺病毒 载体pAD/PL-DEST的配比为6yg: 6yg: 6yg: 3yg。所述切割的条件具体可为37 °C酶切12-16h (过夜）。切割体系为：NEB buffer 3.1缓冲液，50μ1体系，其中所述Cas9蛋白、所述向导 RNA1、所述向导RNA2和所述5型腺病毒载体pAD/PL-DEST的质量依次为6yg、6yg、6yg、3yg。
[0043] (2)以 35 型腺病毒纤毛基因（GenBank:U10272.1，Update:1995-5-12)为模板，采用 由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物； [0044]其中，所述PCR产物自5'端到3'端依次为上游同源臂、所述35型腺病毒纤毛头节和 杆区的编码基因和下游同源臂;所述上游同源臂与所述PAD-DEST 5型腺病毒载体的骨架大 片段的3'端序列相同，所述下游同源臂与所述pAD-DEST 5型腺病毒载体的骨架大片段的5' 端序列相同。所述上游同源臂的核苷酸序列具体为序列表中序列5的第1-21位;所述下游同 源臂的核苷酸序列具体为序列表中序列6的第1-20位的反向互补序列。
[0045] (3)利用Gibson连接法将步骤（1)获得的所述pAD-DEST 5型腺病毒载体的骨架大 片段和步骤(2)获得的所述PCR产物进行同源重组拼接，所得产物即为Ad5F35嵌合型腺病毒 载体。
[0046] 在本发明中，进行所述Gibson连接具体是采用NEB公司生产的Gibson.Assembly? Master Mix进行的。
[0047] 在所述方法的步骤（1)中，所述向导RNA1和所述向导RNA2是按照包括如下步骤的 方法制备获得的：
[0048] (al)合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA;所述正向 单链DNA1的序列如序列表中序列1所示;所述反向单链DNA1的序列如序列表中序列2所示； 合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA;所述正向单链DNA2的序 列如序列表中序列3所示;所述反向单链DNA2的序列如序列表中序列4所示；
[0049] (a2)将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应，得到双链DNA1;将 所述正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应，得到双链DNA2;
[0050] (a3)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经 体外转录获得所述向导RNA1和所述向导RNA2。
[0051 ] 进一步，步骤(a3)中，所述"将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录 向导RNA的载体中"为:将所述双链DNA1与线性化的pUC57_sgRNA expression vector连接 获得pUC57-T7-pADsgRNAl质粒;将所述双链DNA2与所述线性化的pUC57-sgRNA expression vector连接获得pUC57_T7_pADsgRNA2质粒；所述线性化的pUC57_sgRNA expression vector为米用Bsal对pUC57_sgRNA expression vector进行酶切后的产物。
[0052] 具体的，步骤（a3)中，将所述pUC57-T7-pADsgRNAl质粒和所述pUC57-T7-pADsgRNA2质粒分别经体外转录获得所述向导RNA1和所述向导RNA2，为:将所述pUC57-T7-pADsgRNAl质粒和所述pUC57-T7-pADsgRNA2质粒分别采用Dral限制性内切酶进行线性化， 然后利用MEGA shortscript? T7Transcription Kit(货号:AM1354)进行体外转录，从而获 得所述向导RNA1和所述向导RNA2。
[0053] 其中，所述pUC57_sgRNA expression vector为Addgene载体，编号为51132。
[0054] 本发明是点突变试剂盒的改进，点突变试剂盒一般就包括对目的蛋白进行点突 变、构建结构域缺失的截短体等，本发明所提供的适于改造大质粒载体的分子克隆方法，有 效解决了点突变试剂盒对超过l〇kb的大载体进行突变时容易引起二次突变（由于PCR酶保 真性引起的随机突变)的技术难点，同时也有效的解决了大质粒载体用常规的分子生物学 手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造的问题。该方法非常简单、可靠高效，通 过该方法可以有效实现不需考虑载体的酶切位点就可以得到大质粒载体克隆基因的目的， 而且依此方法可以非常容易地完成大质粒载体中片段的替换、插入、缺失等。
【附图说明】
[0055] 图1为Cas9体外实现定点切割断裂位点示意图。其中，阴影部分的碱基为切割断裂 位点位置。
[0056] 图2为pAD/PL-DEST载体上Ad5纤毛基因替换策略示意图。
[0057]图3为Spel限制性内切酶鉴定pAD/PL-DEST载体纤毛基因改造结果图，随机挑取6 个克隆摇菌扩增提取质粒后用Spel鉴定纤毛基因是否改造成功。
[0058]图4为DNA测序证明纤毛基因改造成功，其中28856为反向测序。
【具体实施方式】
[0059] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061 ] 5型腺病毒载体pAD/PL-DEST:全长34 · 864kb，具体为Invitrogen公司生产的pAd/ PL-DEST Gateway Vector Kit中的产品，货号为V494-20。
[0062] pUC57_sgRNA expression vector:Addgene载体，编号为f51132〇
[0063] 大肠杆菌DB3.1:北京博迈德公司产品，货号为CC2702。
[0064] 大肠杆菌Match T1，北京博迈德公司产品，货号为cc100 3。
[0065] Cas9蛋白：PNA Bio(Thousand 0aks，CA)公司产品，其产品目录号为CP01。也可用 北京唯尚立德的Cas9核酸内切酶替代，货号#E025S。