一种简便的dna转导方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学与基因工程技术领域，具体涉及一种基于纳米金属氧化物颗粒作用的简便DNA转导方法。
【背景技术】
[0002]细菌获得外源基因的主要方式为抗性基因的水平转移，即耐药性基因通过质粒、转座子、整合子、嵌和基因、噬菌体等为载体转移，如同一种属之间，甚至亲缘关系较远的G+和G-菌株之间转移，从而获得可遗传的外源基因。外源基因的载体往往是DNA，此外也有一些特殊的材料做成的包裹外壳。但无论DNA的获得、纯化、与载体的连接、宿主的选择导入还是特殊外壳的制备等方面步骤繁琐，技术要求较高，成本高昂。近年来研究中发现氧化钛、氧化铁、氧化铝的纳米颗粒，可以氧化损伤细胞膜，并穿膜进入细胞的内部，且纳米金属氧化物带有一定的正电荷，与带有负电荷的DNA能够结合。因此探究一种基于金属氧化物纳米颗粒载带的步骤简便、技术要求低、成本低廉的细菌转导方法对分子生物学与基因工程技术领域具有重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种基于金属氧化物纳米颗粒载带的简便的细菌转导方法。本发明用纳米氧化钛、氧化铝、氧化铁处理方法进行细菌转化，可以用10ng的DNA与18细胞作用获得15-1O7个转化子。
[0004]本发明的技术方案概述如下:
[0005]一种基于金属氧化物纳米颗粒作用的简便细菌转导方法，包括以下步骤:
[0006](I)挑取新活化的细菌单克隆，接种到1ml Luria-Bertani培养基,在37°C、21Orpm条件下振荡培养至0D_约为I ;
[0007](2)将(I)中的菌体按 1%接种到 1ml Luria-Bertani 培养基,在 37°C、210rpm条件下振荡培养12h ；
[0008](3)用Luria-Bertani培养基将(2)中的菌体稀释100倍，取1.5ml菌体稀释液置于灭菌的1.5ml离心管中，在室温下离心弃上清收集细菌后用100 μ I灭菌生理盐水重悬细胞，离心参数为5000 X 1min ；
[0009](4)向1.5ml离心管中加入浓度为50mmol/L的纳米金属氧化物颗粒悬液20 μ I和10ng质粒DNA，37°C作用40min后，在室温下离心弃上清去除未结合的DNA，灭菌超纯水离心洗涤2次，离心参数为15000X 15min ；
[0010](5)加入(3)中重悬的细胞液90 μ 1，室温作用一定时间，涡轮震荡2min，加入900 μ I Luria-Bertani 培养基，在 37°C、21rpm 条件下振荡复苏 Ih ；；
[0011](6)菌液涂布在含有相应抗生素的选择性平板上，37°C培养，生长的菌落即为转导成功的克隆。
【附图说明】
[0012]附图为本发明采用的纳米氧化铝原子力显微镜照片。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明:
[0014]实施例1本发明大肠杆菌HBlOl转导pBR322质粒及转导得率检测
[0015]材料:pBR322质粒(AmpR、TetR)、大肠杆菌HB101、氧化招纳米颗粒悬液(颗粒
<50nm)、试剂:LB液体培养基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化钠1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C灭菌20min。LB固体培养基为液体配方加入0.9%的琼脂。
[0016]主要实施步骤如下:
[0017](I)挑取新活化的大肠杆菌HBlOl单克隆，接种到1ml LB培养基，37°C，振荡培养8h ；
[0018](2)将菌体按I %接种到1ml LB培养基，37°C，150rpm,振荡过夜培养，至OD6qo约为I ;
[0019](3)菌液用LB培养基稀释10倍，Iml菌体稀释液/1.5mlEP管，室温，4000rpm，离心5min，弃上清，收集细胞，90 μ I LB液体培养基重悬(19个细胞)；
[0020](4) 1.5mlEP管中加入50mM纳米金属氧化物颗粒的悬液20 μ I和10ng DNA, 37°C作用40min,室温，15000rpm, 15min,离心弃上清除去未结合的DNA,灭菌超纯水水洗2次；
[0021](5)加入重悬的90 μ I细胞液,室温作用9h ；
[0022](6)涡轮 2min，加 LB 液体培养基 900 μ 1，37°C，210rpm，振荡复苏 lh。
[0023](7)菌体倾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml、Tet 50mg/ml，37°C静置培养，待长出菌落后观察计数。
[0024]本发明方法获得的转化细菌细胞数1.98 ±0.13 X 17/Ug pBR322
[0025]结论:由上述结果可知，本发明方法可简便、高效实现大肠杆菌HBlOl转导pBR322质粒。
[0026]实施例2本发明大肠杆菌K12转导RP4质粒及转导得率检测
[0027]材料:RP4质粒(AmpR、TetR、KmR)、大肠杆菌K12、氧化招纳米颗粒悬液(颗粒
<50nm)、
[0028]试剂:LB液体培养基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化钠1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C灭菌20min。LB固体培养基为液体配方加入0.9%的琼脂。
[0029]主要实施步骤如下:
[0030](I)挑取新活化的细菌大肠杆菌K12单克隆，接种到1ml LB培养基，37°C，振荡培养8h ；
[0031](2)将菌体按I %接种到1ml LB培养基，37°C，150rpm,振荡过夜培养，至OD6qo约为I ;
[0032](3)菌液用LB培养基稀释10倍，Iml菌体稀释液/1.5mlEP管，室温，4000rpm,离心5min，弃上清，收集细胞，90 μ I LB液体培养基重悬(19个细胞)；
[0033](4) 1.5mlEP管中加入50mM纳米金属氧化物颗粒的悬液20 μ I和10ng DNA, 37°C作用40min,室温，15000rpm, 15min,离心除去未结合的DNA,灭菌超纯水水洗2次；
[0034](5)加入重悬的90 μ I细胞液,室温作用9h ；
[0035](6)涡轮 2min，加 LB 液体培养基 900 μ 1，37°C，210rpm,振荡复苏 Ih ；
[0036](7)菌体倾注在抗性平板中，含 Amp 80 μ g/ml> Tet 50mg/ml、Km 60mg/ml, 37°C静置培养，待长出菌落后观察计数。
[0037]本发明方法获得的耐药细菌细胞数4.03 ±0.55 X 15/Ug RP4
[0038]结论:由上述结果可知，本发明方法可简便、高效实现大肠杆菌K12转导RP4质粒。
[0039]实施例3本发明大肠杆菌K12转导pCFlO质粒及转导得率检测
[0040]材料:pCF10质粒(TetR)、大肠杆菌K12、氧化招纳米颗粒悬液(颗粒< 50nm)、
[0041]试剂:LB液体培养基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化钠1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C灭菌20min。LB固体培养基为液体配方加入0.9%的琼脂。
[0042]主要实施步骤如下:
[0043](I)挑取新活化的细菌大肠杆菌K12单克隆，接种到1ml LB培养基，37°C，振荡培养8h ；
[0044](2)将菌体按I %接种到1ml LB培养基，37°C，150rpm,振荡过夜培养，至OD6qo约为I ;
[0045](3)菌液用LB培养基稀释10倍，Iml菌体稀释液/1.5mlEP管，室温，4000rpm，离心5min，弃上清，收集细胞，90 μ I LB液体培养基重悬(19个细胞)；
[0046](4) 1.5mlEP管中加入50mM纳米金属氧化物颗粒的悬液20 μ I和10ng DNA, 37°C作用40min,室温，15000rpm, 15min,离心除去未结合的DNA,灭菌超纯水水洗2次；
[0047](5)加入重悬的90 μ I细胞液,室温作用9h ；
[0048](6)涡轮 2min，加 LB 液体培养基 900 μ 1，37°C，210rpm,振荡复苏 Ih ；
[0049](7)菌体倾注在抗性平板中，含Tet 50mg/ml，37°C静置培养，待长出菌落后观察计数。
[0050]本发明方法获得的耐药细菌细胞数1.32 ±0.23 X 15/Ug pCFlO
[0051]结论:由上述结果可知，本发明方法可简便、高效实现大肠杆菌K12转导pCFlO质粒。
【主权项】
1.一种简便的DNA转导方法，其特征是包括以下步骤: (1)挑取新活化的细菌单克隆，接种到1mlLuria-Bertani培养基,在37°C、210rpm条件下振荡培养至0D6。。约为I ; (2)将(1)中的菌体按1%接种到1mlLuria-Bertani培养基,在37°C、210rpm条件下振荡培养12h ； (3)用Luria-Bertani培养基将(2)中的菌体稀释100倍，取1.5ml菌体稀释液置于灭菌的1.5ml离心管中，在室温下离心弃上清收集细菌后用100 μ I灭菌生理盐水重悬细胞，离心参数为5000 X 1min ； (4)向1.5ml离心管中加入浓度为50mmol/L的纳米金属氧化物颗粒悬液20μ1和.10ng质粒DNA，37°C作用40min后，在室温下离心弃上清去除未结合的DNA，灭菌超纯水离心洗涤2次，离心参数为15000X 15min ； (5)加入(3)中重悬的细胞液90μ1，室温作用一定时间，涡轮震荡2min，加入.900 μ ILuria-Bertani 培养基，在 37°C、21rpm 条件下振荡复苏 Ih ；； (6)菌液涂布在含有相应抗生素的选择性平板上，37°C培养，生长的菌落即为转导成功的克隆。
【专利摘要】本发明公开了一种简便的DNA转导方法，其主要内容包括：(1)金属氧化物纳米颗粒可载带DNA转导进入细菌；(2)革兰氏阴性菌HB101、K12和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌均可基于纳米金属氧化物颗粒载带实现细菌转导；(3)转导细菌菌株可获得多种外源DNA。本发明的技术和方法步骤简便，简单操作即可实现；本发明技术要求低，无分子生物生物学转化技术要求；本发明成本低廉，得到的转导细菌细胞数目较多；本发明不但能实现革兰氏阴性菌转导，也可以制备革兰氏阳性菌转导。因此本发明中的技术和方法简便、高效、通用、低廉，非常适合实验室研究及工程菌制备等领域。
【IPC分类】C12N15/70
【公开号】CN105602973
【申请号】CN201410668127
【发明人】邱志刚, 李君文, 丁诚实, 金敏, 谌志强, 杨栋, 王新为
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2014年11月20日