专利名称：一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种用于预防犬传染性肝炎的DNA 疫苗pVAXl-CpG-Loop 背景技术-犬传染性肝炎是由犬腺病毒一型(Canine adenovirus-l,CAV-l)引起的急 性败血性疾病，目前预防以灭活苗和减毒苗为主。DNA疫苗，是近年兴起的新型 疫苗，具有抗体效价维持时间长和交叉保护效果好等优点。此外DNA疫苗还具有 以下突出优点(1)能诱发体液及细胞全方位免疫应答，起到预防作用；(2)免 疫保护时间长；(3)生产工艺简单、成本低廉、稳定性好且贮运方便。 发明内容-本发明提供一种预防犬传染性肝炎的DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop，可用于预 防犬传染性肝炎的感染。其作用机理为将犬腺病毒一型抗原基因Loop插入真 核表达载体，将其注射于肌肉组织，使其在肌细胞中表达病毒抗原，经过抗原提 呈过程，可激活体内的体液免疫系统和细胞免疫系统。激活的体液免疫系统可产 生特异的抗体，消除游离在血液中的病毒，预防犬肝炎病毒的入侵；犬腺病毒(Canine adenovirus, CAV)，属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属成 员，各类腺病毒具有相同的结构，外形是无包膜的球形结构，衣壳为二十面体立 体对称，由252个壳粒组成，其中240个非顶角壳粒为六邻体(hexon)，为主要 的包膜蛋白；12个顶角的壳粒称为五邻体(pentcm);还有三聚体蛋白的纤维。 其中五邻体基底一端通过非共价键与三聚体纤维相连，另一端吸附到细胞膜上。 目前，已对六邻体蛋白的结构和功能进行了广泛的研究。每个六邻体是六邻体蛋 白的同源三聚体，是大于900个残基的复杂蛋白。三聚体的六邻体分子有一个五 面体的基底和三角形的塔尖，基底包含两个区域P1、 P2区，塔区由4个环构成 即Loopl、 Loop2、 Lo叩3、 Loop4。 Loopl是最长、最复杂的环，自身折叠许多倍， 与周围环境相互作用。通过一组单克隆抗体来检测不同型的纯化的六邻体蛋白表 明，在六邻体表面有许多的抗原决定簇在这几个环上。对15个不同型的腺病毒 的六邻体蛋白的序列研究表明，基底区Pl、 P2是保守的，变化区主要集中在 Loop 1 、 Loop2上。Loop 1 、 Loop2存在有7个独特的超变区(Hypervar iab 1 e Region， HVR)，在这7个腿s中，HVRl- HVR6出现在Loopl中，HVR7出现在Loop2的塔 尖。其中HVR1、 HVR2、 HVR4、 HVR5、 HVR7中都含有中和抗原决定簇，而且抗原 决定簇至少包括两个或两个以上的HVRs。目前证实六邻体蛋白可以引发极强的 中和反应，中和抗原决定簇主要存在六邻体上，而六邻体中主要抗原决定簇集中 在Loopl区和Loop2区。本发明根据GeneBank中犬腺病毒I型和人腺病毒2型 的六邻体蛋白基因序列及氨基酸序列，设计并合成了 Lo叩l和Loop2基因，连 接两个基因命名为Loop,将Loop克隆到质粒载体pVAXl-CpG，构建疫苗 pVAXl-CpG-Loop; 合成的Loop蛋白核苷酸序列为 LooplAACTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTAACACTTTAGCCCAAGTGCCATTTGCGGGCGCCATT ACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGCTGGGCCCTGAAAGT TGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAGCATCGACCCCACGC ATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAACTGGGGCCGTGGAA CGAAGATTCTATAAAGTGACCACCAACAATAATAATGAAGCTGATGCCCTACTATATACAGAAGATGTG AACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTACAGGTGTACAGGGA CTGGGGCAACAALoop2AACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGGGACCATTAACTAACATGACAGCTATGAAGGTCAATMTCAAAGATTGCCCGCTGCTAACCTTATAGACACATTTGTAAATATTGGCGCCAGATGGTCACCTGATGTAATGGGCCGC本发明犬肝炎病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop的制备方法如下: 1.人工合成犬肝炎病毒Lo叩(Loopl+Loop2)蛋白编码基因 长度860 bp
类型核酸链数双链几何结构线性b)分子类型DNAC)来源人工合成d)序列描述Lo叩蛋白编码基因 5'-CGGGATCCATGMCTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTMCACTTTAGCCCAAGTGCCAT TTGCGGGCGCCATTACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGC TGGGCCCTGAAAGTTGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAG CATCGACCCCACGCATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAA CTGGGGCCGTGGAACGAAGATTCTATAMGTGACCACCAACAATAATAATGMGCTGATGCCCTACTAT ATACAGAAGATGTGAACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTA CAGGTGTACAGGGACTGGGGCAACAACCCGGGTCCCCCGGGAACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGG GACCATTAACTAACATGACAGCTATGAAGGTCAATAATCAAAACTTTCAAACGGACAACACTAACGTGG GTCCCATTCAAAAGATTGGTTTCGGAAATGTTGAGGCCATGGAGATAAATCTCMTGCTAACCTCTTTATAGCTCCTGCTAATGCAAATACCTATGCTTACATGAATGTGAGATTGCCCGCTGCTAACCTTATAGACA CATTTGTAAATATTGGCGCCAGATGGTCACCTGATGTAATGGACTCTGTTAATCCTTTTAACCACCACA GAAATGCAGGACTCCGCTACCGATCACAGCTGCTTGGCAATGGCCGCCTCGAG-3'其中，5'末端的GGATCC为BamH I酶切位点；CCCGGG为Sma I酶切位点；3' 末端CTCGAG是Xho I酶切位点；2.制备DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop:分别用限制性内切酶BamH I和Sma I， Sma I和Xho I先合成Loopl和Loop2 片段，再用BaraHI和XhoI连接Loopl和Loop2合成Loop蛋白编码基因。Lo叩 蛋白编码基因和真核表达载体pVAXl-CpG (pVAXl购自Invitrogen公司，序列和 物理图谱见该公司的产品目录，加CpG基序修饰)进行双酶切，酶切片段分别经 琼脂糖凝胶电泳纯化回收。然后将上述pVAXl-CpG载体酶切片段与Lo叩基因酶
切片段按一定比例混合，通过连接酶进行连接。然后以CaCl2法转化至感受态大 肠杆菌DH5a (购自GIBLC0公司)中，在卡那霉素平板上得到转化子，进行筛 选。筛选到的阳性转化子为重组pVAX1-CpG-Lo叩的工程菌，该工程菌可用于制 备DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop;本发明DNA疫苗是真核表达载体pVAXl-CpG与Loop蛋白编码基因的重组质 粒。该重组质粒含有pUC ori质粒复制起始位点、卡那霉素抗性基因Kanamycin、 一个完整的真核转录翻译单元的巨细胞病毒启动子PCMV、犬腺病毒Loop基因。 本发明DNA疫苗制备工艺简单，成本低廉，其可在真核细胞中表达Loop抗原并 可激活淋巴细胞；
图1:为本发明犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Lo叩的结构示意图 图2:为本发明犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop的构建流程图
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明的制备方法作详细描述。实施例1:犬腺病毒DNA疫苗pVAX卜CpG-Loop的制备DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop结构见图1，构建流程见图21.合成Loop基因DNA (结构如前所述)，5'末端的GGATCC为BamH I酶切位 点；3，末端CTCGAG是Xho I酶切位点； 3.构建pVAXl-CpG-Loop的重组质粒用限制性内切酶BamH I和Xho I对Lo叩基因DNA进行双酶切。反应体系为200ng/pl的Loop基因DNA 5卩1; 10XM Buffer是由pH7. 5 lOOmM-150mMTris-HCl; lOOmM MgCl2; ImM-lOmM 二硫苏糖醇；lOOmM NaCl组成；BamH I酶(10U/pl) lpl; Xho I酶(12U/pl) l卩l;补H20室总体积20卩1。 37。C温浴消化2小时。之后将消化样品进行1-2%低溶点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收Loop 酶切片段。同时，用BamH I和Xho I双酶切pVAXl- CpG载体。反应体系为pVAXl-CpG载体2pl (200ng/卩l); 10XM Buffer 2pl; BaraH I酶(lOU/pl) lyil; Xho I酶(12U/pl) l口l;补H20至总体积20卩1。 37。C温育消化2小时。之后将消化
样品进行1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pVAXl- CpG酶切片段；将上述pVAXl- CpG酶切片段与Loop酶切片段混合，以连接酶进行连接。连接反应体系为200ng/Vl的pVAXl- CpG酶切片段0.5pl; 50ng/pl的Loop 酶切片段lpl;由600mM-660mM Tris-HCl pH7. 6; 60mM-66mM MgCl2; lOOmM 二 硫苏糖醇；ImM ATP组成的连接Buffe lpl;补H20至总体积10pl。连接反应的条件定为12°C 10小时；4. 构建pVAXl-CpG-Loop工程菌将上述连接反应产物以CaC12法转化至感受态大肠杆菌DH5 a中(购于大连宝生物公司)连接产物10卩l与DH5ci(1 2X109细菌/ral)感受态细胞200pl混合，冰浴放置30分钟，42'C2分钟，冰浴10分钟，加入0.6ml 2YT液体培养 基是由18g蛋白胨/L; 10g酵母抽提物/L; 5gNaCl/L组成，37。C培养45分 钟后铺于含卡那霉素的琼脂平板。37'C培养12小时后在琼脂平板上出现转化子。挑选转化子接种在含100pg/ml卡那霉素的3ml 2YT培养基中37'C培养过夜，6，OOOrpm/分钟离心收集菌体，以质粒小量抽提试剂盒(Qiagen)提取质粒DNA。然后用Hind III和Xho I双酶切鉴定。反应体系为200ng/pl的重组质粒10XM Buffer 2pl; lOU/pl Hind III酶12U/卩l Xho I酶l卩l;补H20至总体积20pl。 37'C温育消化2小时。之后将消化样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果可见860bp的Loop片段和2. 99kb的pVAXl-CpG载体片段。说明筛选到的该 阳性转化子为重组pVAXl-CpG-Loop的工程菌；5. 犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop的制备本发明的DNA疫苗是用上述重组工程菌株制备的。培养方式为液体培养。 采用细菌培养。选用2XYT培养基含1. 6-2%胰蛋白胨、1%酵母提取物和0. 5-1% 氯化钠，pH7.0。培养温度为37i:，培养时间为24小时；从扩增后的工程菌中分离纯化质粒DNA，采用常规方法(分子克隆实验指南， 第三版，科学出版社，2002)。具体步骤如下100g湿菌中加入800mL溶液I含50-60mM葡萄糖，25-30raM Tris-Cl pH8.0， 10mM EDTA强烈振荡混匀。加入新鲜配制的IL溶液II含0.2N NaOH，
1% SDS)垂直轻柔混匀，室温5分钟。再加入冰预冷的0. 75L溶液III含1M醋 酸钾，7M醋酸铵pH4.8垂直轻柔混匀，冰浴5分钟。连续流12 000转/分钟4 'C离心取上清。在上清中加入l. 53L异丙醇室温10分钟，连续流12000转/分 钟室温离心留沉淀。加70%乙醇450ml漂洗过夜。10 000转/分钟4。C离心10 分钟留沉淀。加1L pH7. 4的PBS溶解，加终浓度0.1% RNaseA (华美生物工程 有限公司生产)65'C消化30分钟。再加入等体积的PEG溶液含PEG8000 13%， 氯化钠1.6 M，沉淀；12 000转/分钟4'C离心10分钟，留沉淀。200ml PBS 溶解沉淀，加1%体积曲拉通X114混匀，冰浴5-10分钟，37°C 30分钟，37'C 12000转/分钟离心10分钟，取上层水相。最后用0. 45pm和0. 22Pm双层滤膜加压过滤，用PBS缓冲液稀释至lmg / ml，即犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop， 用于肌肉注射。
权利要求
1.一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，其特征在于由犬腺病毒六邻体蛋白中和抗原决定簇改造后的编码基因和真核表达载体构成，改造后的Loop蛋白编码基因的核苷酸序列如下CGGGATCCATGAACTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTAACACTTTAGCCCAAGTGCCATTTGCGGGCGCCATTACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGCTGGGCCCTGAAAGTTGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAGCATCGA CCCCACGCATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAACTGGGGCCGTGGAACGAAGATTCTATAAAGTGACCACCAACAATAATAATGAAGCTGATGCCCTACTATATACAGAAGATGTGAACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTACAGGTGTACAGGGACTGGGGCAACAACCCGGGTCCCCCGGGAACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGGGACCATTAACTAACATGACAGCTATGAAGGTCAATAATCAAAACTTTCAAACGGACAACACTAACGTGGGTCCCATTCAAAAGATTGGTTTCGGAAATGTTGAGGCCATGGAGATAAATCTCAATGCTAACCTCTTTAAAGGTTTTCTCTACTCCAATGTGGCCCTATACCTACCTGATGCCTATAAATACACACCTGATAACATTGTAGCTCCTGCTAATGCAAATACCTATGCTTACATGAATGTGAGATTGCCCGCTGCTAACCTTATAGACACATTTGTAAATATTGGCGCCAGATGGTCACCTGATGTAATGGACTCTGTTAATCCTTTTAACCACCACAGAAATGCAGGACTCCGCTACCGATCACAGCTGCTTGGCAATGGCCGCCTCGAG。
2. 按权利要求1所述的犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Lo叩，其特征在于所说的真 核表达载体为pVAXl-CpG 。
3. 按权利要求1所述的犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop,其特征在于所说的疫 苗制备方法①构建pVAXl-CpG-Loop重组质粒用限制性内切酶BamH I和Xho I对Loop基因DNA进行双酶切。反应体系为 Loop基因DNA 5pl(200ng/pl);10XM Buffer是由pH7. 5 lOOmM-150mM Tris-HC1;100mMMgCl2; IraM-lOmM二硫苏糖醇；lOOmMNaCl组成；BamH I酶(10U/pl) lpl;Xhol酶(12U/pl) lpl;补H20至总体积20pl。 37。C温浴消化2小时。之后将消 化样品进行1-2%低溶点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收Loop酶切片段。同时，用BamHI和Xho I双酶切pVAXl- CpG载体。反应体系为pVAXl- CpG载体2pl(200ng/pl); 10XM Buffer 2]jl; 10U/卩l的BamH I酶lpl; 12U/pl的Xho I酶lpl;补H2O至总体积20pl。 37。C温育消化2小时。之后将消化样品进行1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pVAXl-CpG酶切片段；将上述pVAXl- CpG酶切片段与Loop酶切片段混合，以连接酶进行连接。连接反应体系为pVAXl-CpG酶切片段0. 5pl (200ng/ial); Loop酶切片段lpl (50ng/pl);由600mM-660mM Tris-HC1 pH7. 6; 60mM-66mM MgCl2; lOOmM 二硫苏糖醇；lmMATP组成的连接Buffe 补H2O至总体积10pl。连接反应的条件定为12'C IO小时；连接反应得到连接产物；② 构建pVAXl-CpG-Lo叩工程菌将上述连接产物以CaCl2法转化至感受态大肠杆菌DH5a中，操作如下连接 产物IO卩I与1 2X 10 9细菌/ml的DH5 a和感受态细胞200P1混合，冰浴放置30分钟，42t2分钟，冰浴10分钟，加入0.6ml由18g蛋白胨/L; 10g酵母抽 提物/ L; 5g NaCl / L组成的2YT液体培养基，37'C培养45分钟后铺于含卡那霉 素的琼脂平板。37。C培养12小时后在琼脂平板上出现转化子。挑选转化子接种在含100Pg/ml卡那霉素的3ml 2YT培养基中37。C培养过夜，6， 000rpm/分钟离心收集菌体，以质粒小量抽提试剂盒(Qiagen)提取重组质粒DNA。然后用Hind III和Xhol双酶切鉴定。反应体系为重组质粒lpl (200ng/vil); 10XM Buffer 2卩1;Hind III酶(10U/卩l) lpl; Xho I酶(12U/卩l) lpl;补H2O至总体积20pl。 37"C温育消化2小时。之后将消化样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果可见860bp的 Lo叩片段和2.99kb的pVAXl-CpG载体片段。说明筛选到的该阳性转化子为重组 pVAXl-CpG-Loop的工程菌；③ 犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop的制备本发明的DNA疫苗是用上述重组工程菌株制备的。培养方式为液体培养。采 用细菌培养。选用2XYT培养基含1.6-2%胰蛋白胨、1%酵母提取物和0. 5-1%氯化 钠，pH7.0。培养温度为37。C，培养时间为24小时； 从扩增后的工程菌中分离纯化质粒DNA，采用常规方法具体步骤如下 100g湿菌中加入800mL溶液I含50-60mM葡萄糖，25-30mM Tris-CI pH8. 0, lOmM EDTA强烈振荡混匀。加入新鲜配制的1L溶液II含0. 2N NaOH， 1% SDS 垂直轻柔混匀，室温5分钟。再加入冰预冷的0.75L溶液III含1M醋酸钾，7M醋 酸铵pH4. 8垂直轻柔混匀，冰浴5分钟。连续流12 000转/分钟4。C离心取上清。 在上清中加入1. 53L异丙醇室温10分钟，连续流12000转/分钟室温离心留沉 淀。加70%乙醇450ml漂洗过夜。10 000转/分钟4'C离心10分钟留沉淀。加1L pH7. 4的PBS溶解，加终浓度0. 1% RnaseA 65'C消化30分钟。再加入等体积的PEG 溶液:含PEG8000 13%，氯化钠1. 6 M，沉淀；12 000转/分钟 4。C离心10分钟， 留沉淀。200ml PBS溶解沉淀，加1%体积曲拉通X114混匀，冰浴5-10分钟，37。C 30分钟，37°C 12 000转/分钟离心10分钟，取上层水相。最后用0. 45pm和0. 22pm双层滤膜加压过滤，用PBS缓冲液稀释至lmg / ml，即得犬腺病毒DNA疫 苗pVAX1-CpG-Loop。
全文摘要
本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种用于预防犬传染性肝炎的犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop。它由犬腺病毒六邻体蛋白改造后编码基因插入真核表达载体所构成。该重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α就成pVAX1-CpG-Loop工程菌，可用于制备疫苗pVAX1-CpG-Loop。由于抗原基因Loop编码中和抗体决定簇基因，体内表达的抗原蛋白水平更高，从而增强了体液免疫，起到更好的预防犬肝炎感染的作用。本发明DNA疫苗制备工艺简单，成本低廉，可在真核细胞中表达Loop抗原并可激活淋巴细胞。
文档编号A61P1/16GK101116750SQ20071006185
公开日2008年2月6日 申请日期2007年5月10日 优先权日2007年5月10日
发明者王俊霞 申请人:河北医科大学