专利名称：胶原酶诱导法建立大鼠出血性脑梗死动物模型的方法
技术领域：
本发明涉及一种建立大鼠出血性脑梗死动物模型的方法，用于模拟、研 究和防治人类的出血性脑梗死等医学领域。
背景技术：
脑血管病是一种高发病率、高病死率和高致残率的疾病，严重影响人们 的身体健康和生活质量。在我国国民的死亡原因统计中脑血管病居第二位，约
占14。85%，每年死于脑血管病病人约150万，存活者约2/3留下残疾。脑血管 病中70%左右为缺血性脑卒中，而出血性脑梗死是急性缺血性脑卒中的常见并 发症，出血性脑梗死的发生率国内外报道约为3% 43%,其中大面积脑梗死后 出血发生率更高，约为30% 76. 1%。自从1951年Fisher和Adams首先提出出血 性脑梗死这一临床病理术语至今，出血性脑梗死的确切病理生理机制尚不清 楚， 一些学说仍有争议，亦无确定有效的治疗方法。因而，深入开展出血性 脑梗死病理生理机制的研究，可为预测出血性脑梗死的疾病衍变和预后、以 及为开辟新的药物或基因治疗途径提供理论依据。
局灶性脑缺血的动物实验研究早在1975年就开始应用，因大脑中动脉 (Middle Cerebral Artery MCA)是脑梗死发生最常见的部位，故大鼠急性 大脑中动脉闭塞(Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO)模型在研究中 的应用最为广泛。目前常用的实验性局灶性脑缺血模型有开颅法、线栓法、 光化学法，这些方法各有所长，但都存在一定缺陷。
脑出血的动物实验研究始于20世纪60年代，先后建立了自体血注入的狗、 猴、兔、猫、猪、鼠等动物模型。目前常用的实验性脑出血模型有以下4种 自体血注入法、胶原酶诱导法、微球囊充胀法、自发性脑出血。①自体血注 入脑出血模型不仅可以通过控制注血量做分级实验性脑出血研究，而且因为 是非肝素化自体血，可观察血液凝固过程中血管活性物质释放对脑循环及脑组织的影响，因而较接近临床脑出血，适合研究脑实质出血的自然过程，病 理形态学等特点，可更好地观察凝固过程中各种因子对脑组织代谢和血流的 影响，从而为临床治疗提供依据。这种模型制作方法用于大动物时，产生的 血肿大小和形态较为一致；②胶原酶诱导法与急性脑出血相比，血肿形成 时间长，且出血为一弥漫性渗血与脑组织混合在一起，这是本模型的不足之 处；③微球囊充胀法是一种纯机械性的脑出血模型，尽管这种模型制作方 法简单、易操作、重复性好且无注入自体血模型的诸多弊端，但由于其与临 床脱节太多，除用于脑出血血肿清除方面的研究外，较少应用；④自发性脑 出血；尽管与临床脑出血的病理生理接近，但由于其遗传性血管损害以及模 型的不稳定性、所需时间的不确定性、病灶大小的易变性以及模型的不可比 性，使其应用受到限制。如上所述局灶性脑梗死、脑出血模型的建立均已成熟，但成熟、稳定的 出血性脑梗死动物模型未见报道。用自体血血栓注入法建立局灶性脑梗死动 物模型，然后在不同的时间点经下颌静脉给予尿激酶溶栓，从而建立出血性 脑梗死动物模型，较符合临床上的出血性脑梗死发生的病理生理状态，但由 于该模型的梗死部位及出血部位、出血量及时间的不确定性，使该模型的稳 定性、可重复性较差，不能满足临床应用的要求。鉴于以上建立出血性脑梗 死动物模型的缺点和不足，探索一种新的出血性脑梗死动物模型建立方法， 对于研究和防治人类的出血性脑梗死疾病具有重要意义。 发明内容本发明的目的是提供一种胶原酶诱导法建立大鼠出血性脑梗死动物模型 的方法，用该方法建立的大鼠模型成本低廉、易于复现、稳定性强且与人类情况类似。本发明的构思是这样的胶原酶属于基质金属蛋白酶家族，主要降解胶 原、层粘连蛋白及细胞外基质，病理状态下可参与血脑屏障损伤。大量文献 报道基质金属蛋白酶参与了出血性转化的发生，能作为出血性转化的独立预 测因素。利用上述特点，向MCAO责任侧颈内动脉注入胶原酶，利用血流再 灌注使胶原酶进入大脑中动脉，在梗死所至血管损伤的基础上胶原酶进一步破坏血管，血流再灌注造成大脑中动脉支配区域(梗死区域内)的出血，从 而建立大鼠出血性脑梗死动物模型。
具体说，本发明所说的建立大鼠出血性脑梗死动物模型的方法包括以下
步骤；
(1) 大鼠的准备；
(2) 制备PE套管改良线栓；
取一段PE管，用一段长度和外径小于PE管的钓鱼丝插入PE管一端，将该 端管口封闭并将钓鱼丝固定，在接近PE管封闭端处打一个侧孔，用另一段长 度大于PE管的钓鱼丝作为管芯从上述备好的PE管未封闭端插入直至PE管封闭 处，钓鱼丝剩余部分留于PE管外，以PE管封闭端为起始点，于 10rnm， 15mm， 18mm，20mm处作标记，酒精浸泡消毒、生理盐水冲洗最后浸泡于肝 素中以备用；
(3) 采用线栓法建立SD大鼠的大脑中动脉闭塞模型参照Longa、 Kuga采 用颈外动脉插入线栓法造模；
(4) 大鼠大脑中动脉闭塞成功后，将管芯拔出，向PE套管中注入胶原酶；
(5) 制备再灌注模型；
(6) 将经以上步骤获得的出血性脑梗死大鼠模型放回笼中继续饲养，分别 在术后不同时间点对动物进行行为学评分。
本发明采用三步法建立出血性脑梗死动物模型，是脑梗死模型、胶原酶注 入和缺血再灌注模型的结合。脑梗死模型是沿用最广泛的线栓法，梗死部位较 为恒定且接近临床；胶原酶注入后结合再灌注方法，使梗死与出血的责任动脉 一致，使模型更加接近于临床。以PE套管代替线栓，是本方法的重点体现。向 管中注入不同药物可能会得到与之相对应的不同的模型，也为溶栓疗法的研究 提供了一条新径路。
本发明中，行为学评分采用传统的Longa,Berderson,肢体对称试验，平衡木 试验评分方法，造模效果评定可信性高。
本发明取得的积极效果在于该模型的出血量及出血时间可人为控制，克 服了以往模型出血量及出血时间的不准确性。所选大鼠均为成年雄性SD大鼠，大鼠血管变异率低，提高了造模成功率。手术创伤小，不影响大鼠肢体功能 且行为学评分准确。所建立的大鼠模型具有较好的稳定性和可重复性，更接 近于临床上出血性脑梗死的发生，使系统性、动态性研究出血性脑梗死的病 理生理机制，开辟新的药物治疗途径成为可能。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。本实施例给出的建立出血性脑梗死大鼠模型的方法，包括以下步骤(1) 大鼠的准备选择清洁级雄性SD大鼠，在动物繁育实验室饲养备用。大鼠的体重选择在300-320g的范围，这个体重范围的大鼠颈内动脉起始处至 大脑中动脉开口处的距离稳定约为18.5土0.5 mm，并且易于立体定位。动物 级别为清洁级，以防止其他污染对所建模型的干扰和影响，提高模型的存活 率。给予大鼠标准词料喂养和饮用纯净水，饲养环境为我院动物实验中心多 层层流架。(2) 制备PE套管改良线栓① 所用材料PE管(外径0.38mm、内径0.20腿)，尼龙钓鱼丝(直径 为O. 181mm)， 502胶水。② 制备方法取一段长约40mm的PE管，以长约l咖的尼龙钓鱼丝完全 插入PE管一端，并用502胶水将尼龙钓鱼丝与PE管粘牢固定，将该端封闭。在 尽可能接近PE管封闭端的地方将管打一个侧孔，孔的大小要适中，保证胶原 酶能顺利通过。另以一段长约50mm的尼龙钓鱼丝作为管芯插入上述PE管未封 闭端中，直至PE管封闭处，钓鱼丝剩余部分留于PE管外，此即为制备好的PE 套管，即PE管+管芯(尼龙钓鱼丝)。以PE套管封闭端为起始点，于套管 10mm， 15rran， 18mm，20mm处用记号笔作标记，酒精浸泡消毒、生理盐水冲洗最后 浸泡于肝素中以备用；(3) 用线栓法制备SD大鼠大脑中动脉闭塞模型参照Longa，Kuga线栓法 采用颈外动脉插入套管造模，套管残端埋于皮下；(4) 大鼠大脑中动脉闭塞成功，待大鼠清醒后给予症状学和行为学评分，确定脑梗死模型建立成功后于MCAO后不同时间，如3、 6、 12、 24小时二次麻醉 大鼠并暴露原手术视野，将管芯拔出，颈外动脉以动脉夹夹闭(以防胶原酶回 流)，将含有胶原酶的生理盐水缓慢打入管中，根据胶原酶注入时间和量不同， 可模拟临床上不同时间和不同出血量的出血性脑梗死。打完后将管夹闭数分 钟；
(5) 制备再灌注模型取下动脉夹，将管拔出，实现大脑中动脉的再 灌注。缝合皮下组织与皮肤，常规消毒；
(6) 将经以上步骤获得的出血性脑梗死动物模型放回笼中继续饲养。分 别在术后3 h、 6 h、 12 h、 24 h、 48 h不同时间点对动物进行传统的行为学评 分，包括以下评分①Longa评分法；②Berderson评分法；③肢体对称试 验评分法； 平衡木评分法。
本实施例选用健康雄性SD大鼠可建立类似人类的出血性脑梗死的动物模 型，且出血量及出血时间可相对人为控制，以模拟临床脑梗死后不同的出血 量及出血时间。
权利要求
1、一种胶原酶诱导法建立大鼠出血性脑梗死动物模型的方法，其特征在于包括以下步骤(1)大鼠的准备；(2)制备PE套管改良线栓；取一段PE管，用一段长度和外径小于PE管的钓鱼丝插入PE管一端，将该端管口封闭并将钓鱼丝固定，在接近PE管封闭端处打一个侧孔，用另一段长度大于PE管的钓鱼丝作为管芯从上述备好的PE管未封闭端插入直至PE管封闭处，钓鱼丝剩余部分留于PE管外，以PE管封闭端为起始点，于10mm，15mm，18mm，20mm处作标记，酒精浸泡消毒、生理盐水冲洗最后浸泡于肝素中以备用；(3)采用线栓法建立SD大鼠的大脑中动脉闭塞模型参照Longa、Kuga等采用颈外动脉插入线栓法造模；(4)大鼠大脑中动脉闭塞成功后，将管芯拔出，向PE套管中注入胶原酶；(5)制备再灌注模型；(6)将经以上步骤获得的出血性脑梗死大鼠模型放回笼中继续饲养，分别在术后不同时间点对动物进行行为学评分。
2、 根据权利要求l所述的胶原酶诱导法建立大鼠出血性脑梗死动物模型的 方法，其特征在于大鼠选择清洁级雄性SD大鼠。
全文摘要
本发明涉及一种胶原酶诱导法建立大鼠出血性脑梗死动物模型的方法，包括以下步骤(1)大鼠的准备；(2)制备PE套管改良线栓；(3)采用线栓法建立SD大鼠的大脑中动脉闭塞模型参照Longa、Kuga等采用颈外动脉插入线栓法造模；(4)大鼠大脑中动脉闭塞成功后，将管芯拔出，向PE套管中注入胶原酶；(5)制备再灌注模型；(6)将经以上步骤获得的出血性脑梗死大鼠模型放回笼中继续饲养，分别在术后不同时间点对动物进行行为学评分。本发明所选大鼠为成年雄性SD大鼠，血管变异率低，提高了造模成功率。建立的动物模型出血量及出血时间可人为控制，手术创伤小，不影响大鼠肢体功能且行为学评分准确，具有较好的稳定性和可重复性。
文档编号A61B19/00GK101214169SQ20081005443
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月14日 优先权日2008年1月14日
发明者莹 刘, 刘瑞春, 静 尹, 张祥建, 李俐涛, 燚 杨, 杨晨辉, 范宏光 申请人:河北医科大学第二医院