一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法。利用紫外线对水样中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。该方法在有效灭活水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌的前提下，由于剑水蚤对其体内细菌的庇护作用，避免了现有检测方法采用液氯灭活剑水蚤体表附着细菌的过程中，由于氯分子的渗透作用会对体内微生物产生影响的问题。采用冻融法与超声法破碎剑水蚤身体结构，附加解吸剂洗脱其肠道等器官附着的体内细菌。最后根据生活饮用水标准检验法（GB/T5750.12-2006）中细菌总数的测定方法进行细菌的培养和计数，检测其体内细菌数量。本发明具有准确度高、可靠等优点，具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在饮用水处理工艺中针对剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法。
技术背景
[0002]近年来，我国不断出现剑水蚤类浮游动物穿透饮用水处理工艺系统进入管网的事件，使饮用水安全受到威胁与挑战。水厂的实践证明，水处理工艺不能彻底去除水中剑水蚤，剑水蚤成体肉眼可见，其在水处理工艺系统中的出现带来用户的感官性状问题。同时，剑水蚤可作为细菌的载体或其他致病性原生动物的中间宿主，细菌可在剑水蚤的体表和体内稳定赋存；剑水蚤可对其携带的细菌提供庇护作用，引起水质生物安全问题。有研究表明，剑水蚤的外壳较为坚硬，对化学消毒剂具有较强的耐性，因此灭活剑水蚤体内携带的细菌需要有较长的接触时间:采用液氯灭活，液氯的接触时间达到Ih时其体内细菌的灭活率仅为0.71og。剑水蚤体内存活的细菌可引起水质的二次污染。因此，有效评价剑水蚤类浮游动物体内细菌的灭活率是保证饮用水水质安全的重要依据。
[0003]大量的文献表明，目前国内外可见文献报道的无脊椎类浮游动物体内微生物的检测主要参照Bicha1.F提出的方法。该方法采用液氯将剑水蚤体表微生物有效灭活后，通过超声波细胞破碎仪将浮游动物体表破坏释放其体内微生物。这个方法主要有两个弊端:首先，由于采用液氯消毒会造成消毒剂分子渗透入浮游动物体内，对其体内细菌有一定的灭活作用，会造成检测结果失真；其次，超声波细胞破碎仪有着大功率、高频率的特点，能够破碎组织、细菌、病毒、孢子及其它细胞结构，因而在超声破碎过程中能够杀死部分体内细菌，也会造成检测结果偏低。此外，由于大部分体内细菌都集中在浮游动物的肠道部位，若不将细菌从肠道中释放，会使 浮游动物经超声破碎后向水中释放的体内细菌浓度偏低，也会造成检测结果偏低。
【发明内容】
[0004]为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，利用紫外辐照进行剑水蚤类浮游动物体表细菌的灭活(可同时灭活取样中来自水中的自由细菌)，采用冻融法结合超声波清洗仪振荡来破碎剑水蚤的蚤体，使用解吸剂脱附其体内细菌，最后进行细菌培养和计数进而计算出剑水蚤类浮游动物体内的细菌数量。
[0005]本发明是由以下技术手段实现的:
[0006]一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，包括以下步骤:
[0007](I)从水样中取成体剑水蚤，放入盛有无菌水的无菌容器中；
[0008](2)对容器的中剑水蚤进行紫外照射，灭活水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌；
[0009](3)灭活结束后将剑水蚤转移至无菌离心管中，加入无菌水，置于冰箱中恒温冷冻，冷冻完毕后取出进行恒温融化，再用超声波清洗仪进行超声作用，破碎剑水蚤身体结构；
[0010](4)将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有无菌水的无菌离心管中，加入解吸剂；
[0011](5)对加入解吸剂后的混合液进行离心，洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细菌；
[0012](6)取离心后的上清液，进行细菌培养和菌落计数，计算每个剑水蚤体内的细菌数量。
[0013]上述试验方法中各试验步骤可以优选为如下指标:
[0014]所用解吸剂的各成分的质量浓度分别为氯化钠0.7-1.2%，吐温800.08-0.12%，磷酸氢二钠0.2-0.3%，磷酸二氢钾0.1-0.3%，其余成分为无菌超纯水。
[0015]对培养皿中剑水蚤进行紫外照射的紫外波长为200_275nm，液面处紫外强度为2500-4000 μ ff/cm2,紫外照射时间 20_30min。
[0016]置于冰箱中恒温冷冻温度为-20至-10°C，冷冻时间为l_2h。
[0017]冷冻完毕后取出进行恒温融化的时间为10_20min，温度为20_30°C。
[0018]冷冻完毕取出进行恒温融化后再用超声波清洗仪进行超声l_5min。
[0019]加入解吸剂量为离心管中无菌水体积的5%_20%。
[0020]对加入解吸剂后的混合液进行离心的离心机转速2000-3000rpm、温度20_25°C、离心时间5-lOmin。
[0021]所述步骤(6)是通过GB/T5750.12-2006对细菌量进行检测的。
[0022]本发明与现有技术相比具有以下优点:
[0023]1.体表细菌灭活稳定，对体内细菌影响较小。
[0024]本发明采用紫外线照射消毒技术尤其是使用200_275nm的紫外线进行照射，这种波段的紫外线又称为短波灭菌紫外线。它的穿透能力很弱，无法穿透大部分的透明玻璃及塑料，更不会穿透剑水蚤坚硬的体表外壳。当这种紫外线照射剑水蚤体表时，由于受到剑水蚤体表外壳的保护，紫外线无法穿透体表，保护了其体内细菌免受紫外线照射。
[0025]2.剑水蚤破碎方法可靠，对体内细菌影响较小。
[0026]本发明采用冻融法结合超声波清洗仪振荡。冻融时将样本置于冰箱中恒温冷冻，再经恒温融化，冷冻温度优选为-20至-10°C，融化温度优选为20-30°C。这种低温冷冻，恒温融化对于细菌活性的影响较小。经过I次冻融之后，剑水蚤体表已经开裂，若再经过多次冻融，只需轻微手摇振荡几次，剑水蚤的蚤体即可完全破碎。为最大限度减少对体内细菌的伤害，提出采用超声波清洗仪振荡破碎剑水蚤体表。超声波清洗仪不同于超声波细胞破碎仪，由于其频率低、功率小，对细菌影响很小。
[0027]3.体内细菌解吸附效率高，检测结果更加准确
[0028]Bicha1.F提出的检测方法没有考虑到浮游动物体内细菌附着在肠道等器官上，浮游动物体表破碎后其体内细菌没有完全释放到水中，所以这时水中的细菌浓度偏低，直接吸取上清液进行培养和计数会造成检测结果偏低。本发明通过加入解吸剂，彻底洗脱肠道等器官附着的细菌，使体内细菌完全释放入水中，增加了检测结果的准确性。试验表明，同等条件下进行检测，Bicha1.F提出的方法测定剑水蚤类浮游动物体内菌落形成为457CFU/只，而本发明检测结果为739CFU/只以上，其检测的准确度为Bicha1.F提出的方法的1.62倍以上,大大优于了现有技术。
[0029]本发明操作步骤简单，灵敏度高，稳定性好，对于剑水蚤类浮游动物体内细菌检测效果显著。经过适当改进也可用去检测其它浮游动物体内细菌，适用范围较广，实用性较强，具有较高的可操作性，适合广泛推广与应用。
【具体实施方式】
[0030]以下实施例用用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0031]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032]以下实施例中为了保证实验样本的一致性，所用的剑水蚤类浮游动物取自太湖原水，蚤属为中华窄腹剑水蚤(Limnoithona sinensis)。
[0033]实施例1
[0034]一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，包括以下步骤:
[0035](I)用3mL巴氏吸管从水样中逐个吸取15只成体剑水蚤放入盛有IOOmL无菌水的60mm的无菌培养皿中，置于无菌操作台上。
[0036](2)对培养皿中剑水蚤进行紫外照射，紫外波长为190nm、培养皿液面处紫外强度为2000 u W/cm2、照射时间20min，对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。
[0037](3)灭活结束后将剑水蚤转移至一个1.5mL无菌的离心管中，加入ImL无菌水，置于-8°C的冰箱中恒温冷冻lh，取出后于15°C下恒温融化lOmin，再用超声波清洗仪(功率60W，频率40kHz)进行超声作用Imin，破碎剑水蚤身体结构。
[0038](4)将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有25mL无菌水的50mL无菌离心管中，加入2mL解吸剂，解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠0.7%，吐温800.08%,磷酸氢二钠0.2%,磷酸二氢钾0.1%,其余为无菌超纯水；最后用无菌超纯水定容至30mL。
[0039](5)离心机转速1500rpm、温度20°C、离心时间IOmin,洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细菌。
[0040](6)取ImL离心后的上清液，根据生活饮用水标准检验法(GB/T5750.12-2006)中细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数，细菌总数乘以2即为每个剑水蚤体内细菌数量，结果见表2。
[0041]实施例2
[0042]一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，包括以下步骤:
[0043](I)用3mL巴氏吸管从水样中逐个吸取15只成体剑水蚤放入盛有IOOmL无菌水的60mm的无菌培养皿中，置于无菌操作台上。
[0044](2)对培养皿中剑水蚤进行紫外照射，紫外波长为350nm、培养皿液面处紫外强度为4200 u W/cm2、照射时间20min，对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。
[0045](3)灭活结束后将剑水蚤转移至一个1.5mL无菌的离心管中，加入ImL无菌水，置于-10°C的冰箱中恒温冷冻lh，取出后于25°C下恒温融化lOmin，再用超声波清洗仪(功率60W，频率40kHz)进行超声作用2min，破碎剑水蚤身体结构。
[0046](4)将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有25mL无菌水的50mL无菌离心管中，加入ImL解吸剂，解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠0.7%，吐温800.08%,磷酸氢二钠0.2%,磷酸二氢钾0.1%,其余为无菌超纯水；最后用无菌超纯水定容至30mL。[0047](5)离心机转速1500rpm、温度30°C、离心时间5min,洗脱剑水蚤的肠道等器官附
着的体内细菌。
[0048](6)取ImL离心后的上清液，根据生活饮用水标准检验法(GB/T5750.12-2006)中细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数，细菌总数乘以2即为每个剑水蚤体内细菌数量。
[0049]实施例3
[0050]一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，包括以下步骤:
[0051](I)用3mL巴氏吸管从水样中逐个吸取15只成体剑水蚤放入盛有IOOmL无菌水的60mm的无菌培养皿中，置于无菌操作台上。
[0052](2)对培养皿中剑水蚤进行紫外照射，紫外波长为200nm、培养皿液面处紫外强度为2500 μ W/cm2、照射时间30min，对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。
[0053](3)灭活结束后将剑水蚤转移至一个1.5mL无菌的离心管中，加入ImL无菌水，置于-10°c的冰箱中恒温冷冻lh，取出后于20°C下恒温融化20min，再用超声波清洗仪(功率60W，频率40kHz)进行超声作用3min，破碎剑水蚤身体结构。
[0054](4)将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有25mL无菌水的50mL无菌离心管中，加入5mL解吸剂，解吸剂 各成分的质量浓度分别为氯化钠0.7%，吐温800.08%,磷酸氢二钠0.2%,磷酸二氢钾0.1%,其余为无菌超纯水；最后用无菌超纯水定容至30mL。
[0055](5)离心机转速2000rpm、温度20°C、离心时间IOmin,洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细菌。
[0056](6)取ImL离心后的上清液，根据生活饮用水标准检验法(GB/T5750.12-2006)中细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数，细菌总数乘以2即为每个剑水蚤体内细菌数量。
[0057]实施例4
[0058]一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，包括以下步骤:
[0059](I)用3mL巴氏吸管从水样中逐个吸取15只成体剑水蚤放入盛有IOOmL无菌水的60mm的无菌培养皿中，置于无菌操作台上。
[0060](2)对培养皿中剑水蚤进行紫外照射，紫外波长为225nm、培养皿液面处紫外强度为2800 μ W/cm2、照射时间22min，对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。
[0061](3)灭活结束后将剑水蚤转移至一个1.5mL无菌的离心管中，加入ImL无菌水，置于_18°C的冰箱中恒温冷冻1.5h，取出后于22°C下恒温融化15min，再用超声波清洗仪(功率60W，频率40kHz)进行超声作用5min，破碎剑水蚤身体结构。
[0062](4)将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有25mL无菌水的50mL无菌离心管中，加入3mL解吸剂，解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠0.8%，吐温800.08%,磷酸氢二钠0.23%，磷酸二氢钾0.2%，其余为无菌超纯水；最后用无菌超纯水定容至30mL。
[0063](5)离心机转速2200rpm、温度23°C、离心时间8min,洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细菌。
[0064](6)取ImL离心后的上清液，根据生活饮用水标准检验法(GB/T5750.12-2006)中细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数，细菌总数乘以2即为每个剑水蚤体内细菌数量。[0065]实施例5
[0066]一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，包括以下步骤:
[0067](I)用3mL巴氏吸管从水样中逐个吸取15只成体剑水蚤放入盛有IOOmL无菌水的60mm的无菌培养皿中，置于无菌操作台上。
[0068](2)对培养皿中剑水蚤进行紫外照射，紫外波长为247.5nm、培养皿液面处紫外强度为3000 u W/cm2、照射时间20min，对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。
[0069](3)灭活结束后将剑水蚤转移至一个1.5mL无菌的离心管中，加入ImL无菌水，置于-15°C的冰箱中恒温冷冻2h，取出后于26°C下恒温融化18min，再用超声波清洗仪(功率60W，频率40kHz)进行超声作用2min，破碎剑水蚤身体结构。
[0070](4)将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有25mL无菌水的50mL无菌离心管中，加入2.5mL解吸剂，解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠1.0%，吐温800.1%，磷酸氢二钠0.25%，磷酸二氢钾0.18%，其余为无菌超纯水；最后用无菌超纯水定容至30mL。
[0071](5)离心机转速2600rpm、温度20°C、离心时间8min,洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细菌。
[0072](6)取ImL离心后的上清液，根据生活饮用水标准检验法(GB/T5750.12-2006)中细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数，细菌总数乘以2即为每个剑水蚤体内细菌数量。
[0073]实施例6
[0074]一种剑水蚤类浮游 动物体内细菌的检测方法，包括以下步骤:
[0075](I)用3mL巴氏吸管从水样中逐个吸取15只成体剑水蚤放入盛有IOOmL无菌水的60mm的无菌培养皿中，置于无菌操作台上。
[0076](2)对培养皿中剑水蚤进行紫外照射，紫外波长为253.7nm、培养皿液面处紫外强度为3000 u W/cm2、照射时间20min，对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。
[0077](3)灭活结束后将剑水蚤转移至一个1.5mL无菌的离心管中，加入ImL无菌水，置于-20°C的冰箱中恒温冷冻lh，取出后于25°C下恒温融化lOmin，再用超声波清洗仪(功率60W，频率40kHz)进行超声作用Imin，破碎剑水蚤身体结构。
[0078](4)将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有25mL无菌水的50mL无菌离心管中，加入2mL解吸剂，解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠0.9%、吐温-800.1%、磷酸氢二钠0.283%、磷酸二氢钾0.136%，其余为无菌超纯水；最后用无菌超纯水定容至30mL。
[0079](5)离心机转速2500rpm、温度25°C、离心时间5min,洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细菌。
[0080](6)取ImL离心后的上清液，根据生活饮用水标准检验法(GB/T5750.12-2006)中细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数，细菌总数乘以2即为每个剑水蚤体内细菌数量。
[0081]实施例7
[0082]一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，包括以下步骤:
[0083](I)用3mL巴氏吸管从水样中逐个吸取15只成体剑水蚤放入盛有IOOmL无菌水的60mm的无菌培养皿中，置于无菌操作台上。
[0084](2)对培养皿中剑水蚤进行紫外照射，紫外波长为263nm、培养皿液面处紫外强度为3500 μ W/cm2、照射时间27min，对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。
[0085](3)灭活结束后将剑水蚤转移至一个1.5mL无菌的离心管中，加入ImL无菌水，置于-15°C的冰箱中恒温冷冻2h，取出后于30°C下恒温融化lOmin，再用超声波清洗仪(功率60W，频率40kHz)进行超声作用4min，破碎剑水蚤身体结构。
[0086](4)将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有25mL无菌水的50mL无菌离心管中，加入3.5mL解吸剂，解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠1.1%，吐温800.09%,磷酸氢二钠0.25%，磷酸二氢钾0.25%，其余为无菌超纯水；最后用无菌超纯水定容至30mL。
[0087](5)离心机转速3000rpm、温度20°C、离心时间IOmin,洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细菌。
[0088](6)取ImL离心后的上清液，根据生活饮用水标准检验法(GB/T5750.12-2006)中细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数，细菌总数乘以2即为每个剑水蚤体内细菌数量。
[0089]实施例8
[0090]一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，包括以下步骤:
[0091](I)用3mL巴氏吸管从水样中逐个吸取15只成体剑水蚤放入盛有IOOmL无菌水的60mm的无菌培养皿中，置于无菌操作台上。
[0092](2)对培养皿中剑水蚤进行紫外照射，紫外波长为275nm、培养皿液面处紫外强度为4000 μ W/cm2、照射时间25min，对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。
[0093](3)灭活结束后将剑水蚤转移至一个1.5mL无菌的离心管中，加入ImL无菌水，置于_20°C的冰箱中恒温冷冻lh，取出后于20°C下恒温融化lOmin，再用超声波清洗仪(功率60W，频率40kHz)进行超声作用Imin，破碎剑水蚤身体结构。
[0094](4)将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有25mL无菌水的50mL无菌离心管中，加入1.25ml解吸剂，解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠1.2%，吐温800.12%，磷酸氢二钠0.3%,磷酸二氢钾0.3%,其余为无菌超纯水；最后用无菌超纯水定容至30mL。
[0095](5)离心机转速2000rpm、温度25°C、离心时间5min,洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细菌。
[0096](6)取ImL离心后的上清液，根据生活饮用水标准检验法(GB/T5750.12-2006)中细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数，细菌总数乘以2即为每个剑水蚤体内细菌数量。
[0097]米用Wolmarans.E 提出的方法(Wolmarans, E.，et al., Significance ofbacteria associated with invertebrates in drinking water distributionnetworks.4.World Water Congress:Water and Health.2005:1ffA Publishing, AllianceHousel2Caxton Street London SfflHOQS UK.5-175.),在无菌、恒温振荡条件下将剑水蚤在无菌水中浸泡2-4h，进行其体表携带细菌的释放，取适当体积的水进行紫外灭活后剑水蚤体表附着细菌的检测，同时进行水样中自由细菌检测(生活饮用水标准检验法GB/T5750.12-2006中细菌总数的测定方法)。结果如表I所示。
[0098]表I紫外消毒时间与体表附着细菌存在的关系(每个时间点进行6次试验，取平均值)
[0099][0100]从表I中的数据可以看到，随着紫外线照射时间的增加，剑水蚤体表附着细菌数量逐渐减少，当紫外线照射时间为ISmin时，体表附着细菌没有检出，为保证结果的可靠性，本发明采用20min以上的照射时间；同时培养皿水中的自由细菌在5min时就未有检出。这说明采用紫外照射法，对于剑水蚤体表附着细菌和水中自由细菌的灭活效果显著。
[0101]分别采用本发明中实施例的方法和Bicha1.F提出的方法(Bichai F，BarbeauB，Dullemont Y，et al.Role of predation by zooplankton in transport and fateof protozoan (oo)cysts in granular activated Carbon filtration[J].WaterResearch, 2010，44(4): 1072-1081.)进行剑水蚤类浮游动物体内细菌检测比较，每种方法平行进行3次试验，进行比较。试验所用的剑水蚤样本都是从同一取水地点同一时间收集的剑水蚤，试验时挑选个头一样大的成年剑水蚤，每组试验样本收集条件完全一样，试验结果如表2所示。
[0102]表2本发明的检测方法与Bicha1.F提出的检测方法结果对比
[0103][0105]根据表2的数据结果，可以发现本发明检测到的剑水蚤体内细菌数量明显多于现行Bicha1.F提出的检测方法，且检测结果波动小，其中RSD值都小于3 ;而Bicha1.F提出的检测方法实验结果波动较大，RSD值达到了 20.13，其中实施例1与实施例2是根据本领域技术人员的公知常识任意选取的参数进行的实验，说明利用本发明提供的方法可以实现比现有技术更好的检测效果，而实施例3-8是本发明优选的实验参数范围，通过对比可以发现，其检测效果与现有技术检测手段相比更为突出，其检测的准确度为现有技术的1.88倍以上，大大优于了现有技术。通过上述试验数据对比说明本发明所采用的体表附着细菌紫外线灭活、剑水蚤体表破碎和解吸剂脱附的方法检测效率更高、重现性更好、稳定性更好。
[0106]以上对本发明所提供的剑水蚤类浮游动物体内细菌检测方法进行了详细介绍，并对本发明的【具体实施方式】进行了阐述，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思路在【具体实施方式】及应用范围上可能在实施过程中会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【权利要求】
1.一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)从水样中取成体剑水蚤，放入盛有无菌水的无菌容器中； (2)对容器中的剑水蚤进行紫外照射，灭活水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌； (3)灭活结束后将剑水蚤转移至无菌离心管中，加入无菌水，置于冰箱中恒温冷冻，冷冻完毕后取出进行恒温融化，再用超声波清洗仪进行超声作用，破碎剑水蚤身体结构； (4)将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有无菌水的无菌离心管中，加入解吸剂； (5)对加入解吸剂后的混合液进行离心，洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细菌； (6)取离心后的上清液，进行细菌培养和菌落计数，计算每个剑水蚤体内的细菌数量。
2.根据权利要求1所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，其特征在于，所用解吸剂的各成分的质量浓度分别为氯化钠0.7-1.2%，吐温80 0.08-0.12%，磷酸氢二钠0.2-0.3%，磷酸二氢 钾0.1-0.3%，其余成分为无菌超纯水。
3.根据权利要求1所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，其特征在于，对培养皿中剑水蚤进行紫外照射的紫外波长为200-275nm，液面处紫外强度为2500-4000 u W/cm2,紫外照射时间20-30min。
4.根据权利要求1所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，其特征在于，步骤(3)置于冰箱中恒温冷冻温度为-20至-10°C，冷冻时间为l_2h。
5.根据权利要求1所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，其特征在于，步骤(3)冷冻完毕后取出进行恒温融化的时间为10-20min，温度为20_30°C。
6.根据权利要求1所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，其特征在于，步骤(3)冷冻完毕取出进行恒温融化后再用超声波清洗仪进行超声l_5min。
7.根据权利要求1所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，其特征在于，加入解吸剂量为离心管中无菌水体积的5%-20%。
8.根据权利要求1所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，其特征在于，对加入解吸剂后的混合液进行离心的离心机转速2000-3000rpm、温度20-25 V、离心时间5-10mino
9.根据权利要求1所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法，其特征在于，所述步骤(6)是通过GB/T5750.12-2006对细菌量进行检测的。
【文档编号】C12Q1/06GK103451262SQ201310358527
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】林涛, 陈卫, 蔡博, 吴寿可 申请人:河海大学