不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌的检测方法。选取不同抗性水稻上的褐飞虱，以体内的类酵母共生菌为研究对象，结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)与荧光定量PCR(qPCR)技术进行定量检测。三种抗性水稻品种分别为：ASD7(bph2)、RH(Bph3)、Mudgo(Bph1)。检测的类酵母共生菌为Noda菌(Hypomyceschrysospermus)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、假丝酵母(Candidaquercitrusa)。本发明利用DGGE和qPCR技术检测了褐飞虱体内三种类酵母共生菌在不同抗性水稻品种上的变化规律，为明确褐飞虱在适应抗性品种过程中其体内共生菌的变化规律提供了新的技术手段，对探明飞虱防治的新途径起到了至关重要的作用。
【专利说明】不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌的检测方法
【技术领域】[0001]本发明通过结合变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术对不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌的变化规律进行研究，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]褐飞虱是我国及东南亚水稻上最主要的害虫之一，该虫为单食性害虫，不仅通过产卵或者刺吸水稻韧皮部汁液造成直接伤害，而且通过传播病毒病造成间接伤害，培育和推广抗性品种是遏制褐飞虱肆意繁殖和危害的优先策略；但是长期种植抗性水稻品种导致飞虱产生新的致害性，而把已经产生新致害性的飞虱转移到其他品种的水稻上强迫饲养数代后，飞虱的致害性即发生变化。
[0003]有研究推测褐飞虱致害性的转变可能与飞虱体内的共生菌有关，褐飞虱体内存在着类酵母共生菌(Yeast-like Symbiotes, YLS),是飞風体内的优势菌群。YLS主要聚集在腹部脂肪体和卵中，并随卵传递给下一代。YLS还参与氮素循环，为寄主提供氨基酸、固醇类物质以及蛋白质等多种营养成分，并对稻飞虱生长、发育、繁殖、致害性变化等方面起到重要作用。
[0004]研究发现，取食抗性水稻品种后飞虱体内共生菌的数量急剧下降，特别是在适应抗性品种过程中的第二代，是此过程的关键世代，体内共生菌的数量达到最低，到第三代时，共生菌的数量开始回升。在正常情况下，取食感虫品种TN1的生物型1雌成虫的体重、生长速度和产卵量均显著高于取食抗性水稻品种的雌成虫。因此明确褐飞虱在适应抗性品种过程中其体内共生菌的变化规律对飞虱致害性的变异至关重要。
[0005]然而，褐飞虱体内的类酵母共生菌由于生存环境较为特殊，难以进行体外培养。传统研究褐飞虱体内类酵母共生菌的变化规律的手段主要是基于显微观察法，但这种方法效率低且准确性差。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种不同抗性水稻上褐飞虱体内类酵母共生菌的检测方法。
[0007]褐飞虱是一种重要的农业害虫。研究发现褐飞虱对不同品种抗性水稻的适应性与其体内的类酵母共生菌有密切的联系，明确褐飞虱体内类酵母共生菌的变化规律对飞虱的防治起了至关重要的作用。尚未见有关利用分子生物学技术分析不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌变化的研究报道。
[0008]一种不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌的检测方法，选取不同抗性水稻品种上的最初8个世代的褐飞虱，针对多种类酵母共生菌，结合变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)与突光定量 PCR(Real_timeQuantification PCR, qPCR)技术进行定量检测。
[0009]所述的水稻品种中，抗性水稻品种为ASD7(如AJ?) MBph3)、Mudgo (办力7)，感虫水稻品种为TN1。
[0010]所述的类酵母共生菌为Abt/a菌{Hypomyces chrysospermus)、季也蒙毕赤酵母{Pichia guilliermondii) >{Candida querci trusa) 0 [0011]所述的方法，过程如下:
1)分别取三种抗性水稻品种及一种感虫水稻品种上的最初8个世代刚羽化的褐飞虱，对所述的褐飞虱的脂肪体中的类酵母共生菌进行分离纯化，提取基因组；
2)根据多种菌株的ISSrDNA的特征序列设计引物，以上述提取的基因组为模板进行PCR扩增；
3)利用变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术对多种菌株的变化规律定量分析。
[0012]利用结合DGGE和qPCR技术明确了三种类酵母共生菌在褐飞虱适应抗性品种上最初8代的变化规律:在适应的过程中三种共生菌的数量急剧下降，在第二代时三种共生菌的数量均达到最低，到第三代时，共生菌的数量开始回升，之后共生菌的数量趋于平缓。三种共生菌的数量在同一世代不同抗性水稻上的变化不尽相同，Pi chi a gui lli ermondi i和Candida querci trusa在同一世代不同抗性水稻之间的差异不显著，但是Hypomyceschrysospermus在三种抗性水稻上的差异显著，特别是在抗性水稻品种Mudgo上,与其他两种抗性水稻品种相比差异显著。另外对三种菌在三种抗性水稻品种的原始拷贝数分析，发MiHypomyces chrysospermus 在三种共生菌中数量最多，其次是gui lli ermondi i,最后是 Candida querci trusa。
[0013]本发明的有益效果:
本发明利用DGGE和qPCR技术分别检测了三种类酵母共生菌在褐飞虱适应三种抗性水稻品种上最初八个世代的变化规律，为今后研究类酵母共生菌与褐飞虱对不同抗性水稻品种适应以及探索新的防治途径提供了有效的技术手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是办菌在三种抗性水稻品种上的褐飞風体内变化规律的 DGGE 图；A: Mudgo, B: ASD7、C:RH。
[0015]图2 ^kPichia gui lli ermondi i菌在三种抗性水稻品种上的褐飞風体内变化规律DGGE 图；A: Mudgo、B: RH、C:ASD7。
[0016]图3是菌在三种抗性水稻品种上的褐飞風体内变化规律DGGE 图；A: RH、B: Mudgo、C:ASD7。
[0017]图4A是Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品种ASD7上特异序列扩增的标准曲线。
[0018]图4B是Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品种RH上特异序列扩增的标准曲线。
[0019]图4C ^kHypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品种Mudgo上特异序列扩增的标准曲线。
[0020]图5A iPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品种ASD7上特异序列扩增的标准曲线。
[0021 ] 图5B ^kPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品种RH上特异序列扩增的标准曲线。
[0022]图5C iPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品种Mudgo上特异序列扩增的标准曲线。
[0023]图6A是Candida querci trusa菌在抗性水稻品种ASD7上特异序列扩增的标准曲线。
[0024]图现是Candi da querci trusa菌在抗性水稻品种RH上特异序列扩增的标准曲线。
[0025]图6C是Candida querci trusa菌在抗性水稻品种Mudgo上特异序列扩增的标准曲线。
[0026]图7A是Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品种ASD7上特异序列扩增的熔解曲线。
[0027]图7B良Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品种RH上特异序列扩增的熔解曲线。
[0028]图^kHypomyces菌在抗性水稻品种Mudgo上特异序列扩增的熔解曲线。
[0029]图8A ^kPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品种ASD7上特异序列扩增的熔解曲线。
[0030]图8B ^kPichia guilliermondii菌在抗性水稻品种RH上特异序列扩增的熔解曲线。
[0031]图8C ^kPichia gui `lli ermondi i菌在抗性水稻品种Mudgo上特异序列扩增的熔解曲线。
[0032]图9A是Candida querci trusa菌在抗性水稻品种ASD7上特异序列扩增的熔解曲线。
[0033]图视是Candi da querci trusa菌在抗性水稻品种RH上特异序列扩增的熔解曲线。
[0034]图9C是Candida querci trusa菌在抗性水稻品种Mudgo上特异序列扩增的熔解曲线。
[0035]具体实施方法
以下结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步的说明。
[0036]实施例1:用DGGE技术分别对三种抗性水稻品种(ASD7、RH、Mudgo)上褐飞虱三种舊 Qiypomyces chrysospermus 鬼、Pichia guilliermondii |if> Candida querci trusa 舊、的半定量分析。
[0037]取在感虫品种TN1，抗性品种ASD7 (8个世代)、RH (8个世代)、Mudgo (8个世代)上刚羽化的雌成虫各100头，75%酒精表面消毒3次，每次3min，无菌水漂洗3次，每次3min。对其脂肪体中的类酵母共生菌进行分离纯化，并提取基因组。以上述提取的基因组为模板，扩增所用引物为依据利用DGGE实验中获得的3种菌18SrDNA序列设计的引物310F/310R(Hypomyces chrysospermus), 305F/305R {Pichia guilliermondii ), 248F/248R {Candidaquerci trusa),为了崔i高DGGE的检测效率，在三对上游引物的5’端添加约40个碱基的GC夹子(表1)。
[0038]表1三种菌的引物序列
【权利要求】
1.一种不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌的检测方法，其特征在于，选取不同抗性水稻品种上的最初8个世代的褐飞虱，针对多种类酵母共生菌，结合变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术进行定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水稻品种中，抗性水稻品种为ASD7 {bph2)、RH {Bph3)、Mudgo {Bphl)，感虫水稻品种为 TN1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的类酵母共生菌为舱山菌Qiypomyces chrysospermus)、季也蒙毕赤酵母 ipichia gui Hi ermondi i)、假丝酵母{Candida quercitrusa) 0
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，过程如下: 1)分别取三种抗性水稻品种及一种感虫水稻品种上的最初8个世代刚羽化的褐飞虱，对所述的褐飞虱的脂肪体中的类酵母共生菌进行分离纯化，提取基因组； 2)根据多种菌株的ISSrDNA的特征序列设计引物，以上述提取的基因组为模板进行PCR扩增； 3)利用变性梯度凝`胶电泳与荧光定量PCR技术对多种菌株的变化规律定量分析。
【文档编号】C12Q1/04GK103555821SQ201310358301
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年8月17日 优先权日:2013年8月17日
【发明者】俞晓平, 马正, 曹伟, 侯云, 边亚琳, 郝培应, 许益鹏, 申屠旭萍 申请人:中国计量学院