啤酒酵母可溶性1,3-β-D-葡聚糖的生物提炼及纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种啤酒酵母可溶性1,3-β-D-葡聚糖的生物提炼及纯化方法。目前对酵母细胞壁中可溶性1,3-β-D-葡聚糖的提取，工艺不具备连续性。本发明在同一反应体系中，利用超声波、中性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶将酵母细胞进行降解，利用截留分子量在10-50kD超滤膜，对其中分子量的10-50kD的可溶性1,3-β-D-葡聚糖进行抽提，得到分子量在10-50kD的可溶性1,3-β-D-葡聚糖。本发明具有工艺流程短、生产安全性高、产品的分子量范围固定的优点，所获产品具有溶解性高、稳定性好、安全性高的特点，适用于食品、医药、化妆品、农药、新材料、电子、环保等领域。
【专利说明】啤酒酵母可溶性1, 3- β -D-葡聚糖的生物提炼及纯化方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种葡聚糖,具体涉及一种啤酒酵母可溶性I, 3-β-D-葡聚糖的生物提炼及纯化方法。
【背景技术】
[0002]葡聚糖是一种完全由a-D-吡喃型葡萄糖单体组成的多糖，在植物、真菌、细菌中有着广泛的分布，是细胞壁结构的主要骨架。酵母的细胞壁中的β_葡聚糖是人类发现的第一个具有免疫活性的葡聚糖，在随后的研究中，人们又发现他还具有抗感染、抗肿瘤、抗辐射和促进伤口愈合等功能，是一种重要的生物效应应答剂。
[0003]酵母细胞壁中1，3_β-D-葡聚糖占到了葡聚糖的结构是在D-葡萄糖基C6位上由β_1，3糖苷键和另一个葡萄糖基相连，在β_1，3糖苷键连接的主链上具有小的β_1，6糖苷键连接分支，其中β-1，6糖苷键分支占总I，3-β-D-葡聚糖的3%。在酵母细胞壁中，1，3-β -D-葡聚糖随着分子量的不同，空间构型呈单链梳状结构、双股螺旋和三股螺旋结构，溶解性和生物活性也有所不同。现有的研究表明，分子量在240KDa左右的l，3-13-D-葡聚糖，具有最高的生物活性。但是大分子量的1，3-β-D-葡聚糖在水溶液中有着将分子结构向三股螺旋结构转化的趋势，溶解性也会减小，在制药行业当中会造成制剂的溶解性不稳定，限制了其在临床上的使用。分子量在10-50KDa的水溶性小分子1，3-β -D-葡聚糖，在保持了大分子结构的生物活性同时，还具有很好的溶解性，分子结构也比较稳定。
[0004]我国是啤酒生产大国，每年因啤酒生产而产生的啤酒酵母泥达到了 3-5万吨(以干基计)。这些酵母泥被作为粗饲料廉价出售，甚至直接排放，对资源造成极大的浪费，也污染了环境。对其中l，3-13_D-葡聚`糖进行提取利用，就可以延长啤酒行业的产业链，增加啤酒产业的附加值。
[0005]目前对酵母细胞壁中可溶性1，3_β-D-葡聚糖的提取，一般采用酸、碱制备不溶性葡聚糖，然后利用酶法或化学修饰法进行增溶，工艺不具备连续性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种工艺具有连续性的啤酒酵母可溶性1，3_β -D-葡聚糖的生物提炼及纯化方法。
[0007]本发明所采用的技术方案是:
啤酒酵母可溶性l，3-13_D-葡聚糖的生物提炼及纯化方法，其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:发酵罐底取新鲜酵母泥120-890g，以过量蒸馏水反复洗涤，每分钟4000转离心20分钟，直到上清液无色清澈、苯酚-硫酸法测不到糖为止；
步骤二:补水到5 L，搅拌，固形物含量为2-15%，把超声波细胞粉碎仪的超声波发生器置于混合液中，超声功率400-600W，工作时间5-10秒，间隔时间10秒，总超声时间20-30分钟，进行破壁；步骤三:继续补水5 L进行稀释，调pH值6.0-8.0，煮沸后冷却到50±2°C，按酵母干重的0.5-1.5%添加甘露聚糖酶，按200-250U /g添加中性蛋白酶，反应24-28小时；
步骤四:调PH5.0，按酵母干重的0.5-1.5%添加β-葡聚糖酶，反应4小时后取30%，离心分离，收集上清液，不溶物质返回最初反应体系中，同时补水到开始反应时的体积，此过程不断循环，5-16小时后终止反应，合并上清液；
步骤五:上清液煮沸，降温到40°C，在0.2MPa条件下，使料液先通过PES-10，30分钟，截留分子量10kD，收集透过液，使之再通过PES-50，30分钟，截留分子量50kD，在此过程中不断补充上清液，采取外源冷循环水降温的方法使温度恒定在40°C ；
步骤六:收集PES-50的浓缩液直到膜通量低于25 L/m-1，将浓缩液真空回旋干燥，得到干粉状可溶性1，3-β -D-葡聚糖。
[0008]本发明具有以下优点:
本发明采用超声波和多种生物酶进行酵母细胞的破壁和解链，利用超滤技术进行10-50kD分子量的可溶性1，3-β -D-葡聚糖提取，在实现提取工艺的连续生产的同时，控制产品的分子量。此工艺不破坏原料中其他有效成分，对工艺过程中的其他有利用价值成分可以再次利用。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为本发明提取具有生物活性的10_50kD的可溶性1，3- β -D-葡聚糖工艺流程框图。
【具体实施方式】
[0010]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0011]本发明所述的酵母细胞，不仅指啤酒厂生产完成后剩余的啤酒酵母泥，亦包括啤酒酵母干燥后获得的有生物活性和没有生物活性的啤酒酵母干粉。
[0012]本发明所述的酵母调成乳状，是指酵母干重占总体积的2-15 (优选为2-10%)。中性蛋白酶按照每克酵母干重210U添加，甘露聚糖酶和葡聚糖酶均选取诺维信公司产品，按照酵母干重的千分之一添加。
[0013]本发明中选取的截留分子量为IOkD的超滤膜和截留分子量为50kD的超滤膜，是指以β葡聚糖为标准物质标示的超滤膜，工艺中涉及到的膜面压力和液体温度，以生产厂家推荐最佳条件为准。
[0014]本发明中所采用的酶制剂和啤酒酵母原料，均为食品级，所以安全无毒。
[0015] 本发明的提取原理为:通过对啤酒酵母原料，进行超声波粉碎，增大酶促反应的接触面积，然后利用蛋白酶和甘露聚糖酶对酵母细胞壁中和酵母细胞内的蛋白质和甘露聚糖进行分解，使之成为可溶性小分子物质，在超滤提纯阶段予以排除。通过β葡聚糖酶的使用，把大分子不溶性葡聚糖分解为小分子的可溶性葡聚糖，通过选取截留分子量为IOkD的超滤膜和截留分子量为50kD的超滤膜连用，抽提出分子量在10-50kD的可溶性1，3_ β -D-匍聚糖。
[0016]本发明的最终产品以水溶性的粉剂形式存在。该产品(经过精制后)可以作为添加剂应用在食品、医药、化妆品、新材料等领域。[0017]以下实施例中的原料和试剂均为食品级，其来源及规格如下:
组分规格产地
啤酒酵母食品级西安汉斯啤酒厂
甘露聚糖酶食品级诺维信公司
β -葡聚糖酶食品级诺维信公司
中性蛋白酶5万/g江苏锐阳生物科技有限公司
膜分离系统LABSTAR-UF5 北京安石环境工程有限公司
超声波发生器 KQ-100DE昆山市超声仪器有限公司
啤酒酵母可溶性l，3-13-D-葡聚糖的生物提炼及纯化方法，其特征在于:
由以下步骤实现:
啤酒酵母可溶性l，3-13-D-葡聚糖的生物提炼及纯化方法，其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:发酵罐底取新鲜酵母泥120-890g，以过量蒸馏水反复洗涤，每分钟4000转离心20分钟，直到上清液无色清澈、苯酚-硫酸法测不到糖为止；
步骤二:补水到5 L，搅拌，固形物含量为2-15%，把超声波细胞粉碎仪的超声波发生器置于混合液中，超声功率400-600W，工作时间5-10秒，间隔时间10秒，总超声时间20-30分钟，进行破壁；
步骤三:继续补水5 L进行稀释，调pH值6.0-8.0，煮沸后冷却到50 ±2 °C，按酵母干重的0.5-1.5%添加甘露聚糖酶，按200-250U /g添加中性蛋白酶，反应24-28小时；
步骤四:调PH5.0，按酵母干重的0.5-1.5%添加β-葡聚糖酶，反应4小时后取30%，离心分离，收集上清液，不溶物质返回最初反应体系中，同时补水到开始反应时的体积，此过程不断循环，5-16小时后终止反应，合并上清液；
步骤五:上清液煮沸，降温到40°C，在0.2MPa条件下，使料液先通过PES-10，30分钟，截留分子量10kD，收集透过液，使之再通过PES-50，30分钟，截留分子量50kD，在此过程中不断补充上清液，采取外源冷循环水降温的方法使温度恒定在40°C ；
步骤六:收集PES-50的浓缩液直到膜通量低于25 L/π-1，将浓缩液真空回旋干燥，得到干粉状可溶性1，3-β -D-葡聚糖。
[0018]实施例1:
步骤一:发酵罐底取新鲜酵母泥120g，以过量蒸馏水反复洗涤，每分钟4000转离心20分钟，直到上清液无色清澈、苯酚-硫酸法测不到糖为止；
步骤二:补水到5 L，固形物含量为2%，搅拌，把超声波细胞粉碎仪的超声波发生器置于混合液中，超声功率400W，工作时间5秒，间隔时间10秒，总超声时间20分钟，进行破壁；步骤三:继续补水5 L进行稀释，调pH值6.0，煮沸后冷却到48 °C，按酵母干重的0.5%添加甘露聚糖酶，按200U /g添加中性蛋白酶，反应24小时；
步骤四:调PH5.0,按酵母干重的0.5%添加β -葡聚糖酶，反应4小时后取30%，离心分离，收集上清液，不溶物质返回最初反应体系中，同时补水到开始反应时的体积，此过程不断循环，5小时后终止反应,合并上清液；
步骤五:上清液煮沸，降温到40°C，在0.2MPa条件下，使料液先通过PES-10，30分钟，截留分子量10kD，收集透过液，使之再通过PES-50，30分钟，截留分子量50kD，在此过程中不断补充上清液，采取外源冷循环水降温的方法使温度恒定在40°C ；
步骤六:收集PES-50的浓缩液直到膜通量低于25 L/m2--h—1，将浓缩液真空回旋干燥，得到干粉状可溶性1，3-β -D-葡聚糖，经检测，干粉含水量为18%，其中可溶性1，3-β -D-葡聚糖含量为63.2%，产品对酵母干重收率为6.38%。
[0019]实施例2:
步骤一:发酵罐底取新鲜酵母泥535g，以过量蒸馏水反复洗涤，每分钟4000转离心20分钟，直到上清液无色清澈、苯酚-硫酸法测不到糖为止；
步骤二:补水到5 L，固形物含量为9%，搅拌，把超声波细胞粉碎仪的超声波发生器置于混合液中，超声功率500W，工作时间7秒，间隔时间10秒，总超声时间25分钟，进行破壁；步骤三:继续补水5 L进行稀释，调pH值7.0，煮沸后冷却到50°C，按酵母干重的1%添加甘露聚糖酶，按210U /g添加中性蛋白酶，反应26小时；
步骤四:调PH5.0，按酵母干重的1%添加β-葡聚糖酶，反应4小时后取30%，离心分离，收集上清液，不溶物质返回最初反应体系中，同时补水到开始反应时的体积，此过程不断循环，8小时后终止反应,合并上清液；
步骤五:上清液煮沸，降温到40°C，在0.2MPa条件下，使料液先通过PES-10，30分钟，截留分子量10kD，收集透过液，使之再通过PES-50，30分钟，截留分子量50kD，在此过程中不断补充上清液，采取外源冷循环水降温的方法使温度恒定在40°C ；
步骤六:收集PES-50的浓缩液直到膜通量低于25 L/nT2--!!—1，将浓缩液真空回旋干燥，得到干粉状可溶性1，3- β -D-葡聚糖5.73g，经检测，干粉含水量为15%，其中可溶性
I,3- β -D-葡聚糖含量为64.3%，产品对酵母干重收率为6.51%。
[0020]实施例3:
步骤一:发酵罐底取新鲜酵母泥890g，固形物含量为15.84%，以过量蒸馏水反复洗涤，每分钟4000转离心20分钟，直到上清液无色清澈、苯酚-硫酸法测不到糖为止；
步骤二:补水到5 L，使固形物含量15%，搅拌，把超声波细胞粉碎仪的超声波发生器置于混合液中，超声功率600W，工作时间10秒，间隔时间10秒，总超声时间30分钟，进行破壁；
步骤三:继续补水5 L进行稀释，调pH值8.0，煮沸后冷却到52°C，按酵母干重的1.5%添加甘露聚糖酶，按250U /g添加中性蛋白酶，反应28小时；
步骤四:调PH5.0,按酵母干重的1.5%添加β -葡聚糖酶，反应4小时后取30%，离心分离，收集上清液，不溶物质返回最初反应体系中，同时补水到开始反应时的体积，此过程不断循环，16小时后终止反应,合并上清液；
步骤五:上清液煮沸，降温到40°C，在0.2MPa条件下，使料液先通过PES-10，30分钟，截留分子量10kD，收集透过液，使之再通过PES-50，30分钟，截留分子量50kD，在此过程中不断补充上清液，采取外源冷循环水降温的方法使温度恒定在40°C ；
步骤六:收集PES-50的浓缩液直到膜通量低于25 L/m-2--h—1，将浓缩液真空回旋干燥，得到干粉状可溶性1，3-β -D-葡聚糖，经检测，干粉含水量为14%，其中可溶性1，3-β -D-葡聚糖含量为62.1%，产品对酵母干重收率为6.16%。
[0021]本发明在同一体系内，利用超声波和生物酶进行啤酒酵母中不溶性物质进行可溶性降解，利用超滤膜连用提取出溶解性稳定的可溶性1，3-β -D-葡聚糖，在整个工艺流程中不引入其他化学成分，实现关键点上的连续操作。产品经过高压液相色谱检测(检测方法出自《药学学报》1989，24 (7)，“高效凝胶色谱法测定多糖纯度及分子量”)，分子量为10-50kD的可溶性1，3-β -D-葡聚糖纯度在60%以上。该工艺与现有的制备可溶性1，3-β-?-葡聚糖工艺相比，具有工艺流程短、条件温和、原料利用率高、产品分子量确定的优点。本工艺为提取具有生物活性的10_50kD的可溶性1，3-β -D-葡聚糖提供了一个新的途径。
[0022]本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换， 均为本发明的权利要求所涵盖。
【权利要求】
1.啤酒酵母可溶性1，3-β -D-葡聚糖的生物提炼及纯化方法，其特征在于: 由以下步骤实现: 步骤一:发酵罐底取新鲜酵母泥120-890g，以过量蒸馏水反复洗涤，每分钟4000转离心20分钟，直到上清液无色清澈、苯酚-硫酸法测不到糖为止； 步骤二:补水到5 L，搅拌，固形物含量为2-15%，把超声波细胞粉碎仪的超声波发生器置于混合液中，超声功率400-600W，工作时间5-10秒，间隔时间10秒，总超声时间20-30分钟，进行破壁； 步骤三:继续补水5 L进行稀释，调pH值6.0-8.0，煮沸后冷却到50 ±2 °C，按酵母干重的0.5-1.5%添加甘露聚糖酶，按200-250U /g添加中性蛋白酶，反应24-28小时； 步骤四:调PH5.0，按酵母干重的0.5-1.5%添加β-葡聚糖酶，反应4小时后取30%，离心分离，收集上清液，不溶物质返回最初反应体系中，同时补水到开始反应时的体积，此过程不断循环，5-16小时后终止反应，合并上清液； 步骤五:上清液煮沸，降温到40°C，在0.2MPa条件下，使料液先通过PES-10，30分钟，截留分子量10kD，收集透过液，使之再通过PES-50，30分钟，截留分子量50kD，在此过程中不断补充上清液，采取外源冷循环水降温的方法使温度恒定在40°C ； 步骤六:收集PES-50的浓缩液直到膜通量低于25 L/m-2--!!-1，将浓缩液真空回旋干燥，得到干粉状可溶性1，3-β -D-葡聚糖。
【文档编号】C12P19/04GK103468765SQ201310425105
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】李皎, 杨国武, 汪大敏, 邓媛 申请人:陕西省微生物研究所