一种大鲵虹彩病毒病疫苗及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种大鲵虹彩病毒病疫苗及制备方法和应用。本发明的大鲵虹彩病毒病疫苗为将大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白基因截短优化后翻译的重组蛋白，其序列为SEQIDNO.2所示。将该蛋白对应的核苷酸序列按酵母密码子偏好性进行优化，合成该基因片段，转入酵母表达载体，通过高拷贝克隆的筛选，最终获得了一株高表达的重组蛋白的巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCP Pichiapastoris Km71/GSIV-MCP，CCTCC NO：M2014573。利用该酵母发酵生产的蛋白具备活性高，产量大的特点。通过免疫保护实验确定了该抗原蛋白能有效的预防大鲵虹彩病毒病。CCTCC NO：M201457320141118
【专利说明】一种大鲵虹彩病毒病疫苗及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种大鲷虹彩病毒病疫苗及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 中国大鲷（Andrias davidianus)是现存个体最大的两栖动物，俗名"娃娃鱼"，是 我国的珍贵特产，属于国家二级保护动物。近年来在我国的陕西、湖北、湖南、浙江、贵州等 省份的大鲷主养区暴发了大鲷病毒性出血病，该病可感染各种规格的养殖大鲷，死亡率高 达90 %以上，给大鲷养殖业造成了巨大的经济损失。
[0003] 大鲷病毒性出血病的病原为大鲷虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，GSIV)，是虹彩病毒科（Iridoviridae)，娃病毒属（Ranavirus)的成员。虹 彩病毒（Iridoviruses)是一类病毒粒子较大，呈二十面体状的双链DNA病毒。虹彩 病毒科（Iridoviridae)分为五个属：绿虹彩病毒属（Chloriridovirus),虹彩病毒属 (Iridovirus)，淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus)，巨大细胞病毒属（Megalocytivirus) 和蛙病毒属（Ranavirus)。虹彩病毒可感染无脊椎动物（绿虹彩病毒属，虹彩病毒属）及变 温脊椎动物（蛙病毒属，淋巴囊肿病毒属，巨大细胞病毒属），包括两栖类、爬行类、甲壳类、 软体动物、昆虫及鱼类等。脊椎动物虹彩病毒，尤其是蛙病毒属的一些成员已经成为导致变 温动物发病的一个重要原因。主要衣壳蛋白（Major Capsid Prote in，MCP)基因为虹彩 病毒的一个晚期基因，在虹彩病毒感染的晚期大量表达，编码的主要衣壳蛋白分子量约为 50kD，构成病毒的二十面体衣壳。比较虹彩病毒MCP基因的氨基酸序列发现，虹彩病毒MCP 基因的氨基酸序列是高度保守的，同一属的同源性一般在90%以上，不同属之间的同源性 一般为40% -50%左右。很多
【发明者】针对各自虹彩病毒MCP制备疫苗，但通过体外重组表 达全长MCP作为疫苗，因生产过程中MCP表达量少，导致制备成本增加。本发明通过对大鲷 虹彩病毒MCP蛋白进行分析，选择亲水性和抗原性强的区域表达制备疫苗。
[0004] 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)是一种新型真核表达系统，能稳定高效表达 外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目的 蛋白的工业化生产提供了保障。自1984年应用毕赤酵母表达外源蛋白以来，已有400多种 蛋白在该系统中成功表达，部分成果已进入商品化生产。
[0005] 由于遗传密码具有简并性，一种氨基酸可以有1-6个使用频率不同的同义密码 子。对于特定的物种，高表达的基因往往使用部分特定的同义密码子，这些密码子被认为是 该物种高表达基因的优越密码子，这种现象称为密码子偏爱性。密码子的偏爱性使得克隆 的外源基因往往难以在异种生物细胞高效表达。在酵母中获得高效表达的外源基因往往 都是酵母偏爱密码子所编码的基因，通过对酵母基因使用密码子的统计分析证实所有的61 个密码子中有25个是酵母所偏爱的，因此对密码子进行偏爱性改造能大量提高重组蛋白 在该系统中的表达量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供了一种大鲷虹彩病毒病疫苗，该疫苗为大鲷虹彩病毒主 衣壳蛋白截短优化的重组蛋白，其序列为SEQ ID NO. 2所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供了一种大鲷虹彩病毒病疫苗的制备方法， 申请人:提 供了一株巴斯德毕赤酵母 Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP 菌株，该菌株 包含有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，将该菌株发酵可制备大鲷虹彩病毒病疫苗。该菌 株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO :M2014573， 分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP，地址：中国 武汉武汉大学。
[0008] 本发明的最后一个目的在于提供了一种大鲷虹彩病毒病疫苗在制备大鲷虹彩病 毒疫苗中的应用。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0010] 一种大鲷虹彩病毒病疫苗的获得：
[0011] 分析Genbank公布的大鲷虹彩病毒主衣壳蛋白基因（JN615141. 1)，找到亲水性和 抗原性强的区域，按酵母密码子偏好性进行优化，合成该基因片段，其序列为SEQ ID NO. 1 所示，根据优化片段的基因序列设计引物（JDMCP1F和JDMCP1R)进行PCR反应，克隆获得截 短优化的主衣壳蛋白基因，转入酵母表达载体，获得重组表达载体，然后再将其导入酵母表 达菌种，筛选高拷贝克隆，获得重组毕赤酵母表达菌，该菌株已于2014年11月18日保藏于 中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC N0:M2014573,分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/ GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP，地址：中国武汉武汉大学。
[0012] 上述巴斯德毕赤酵母 Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP CCTCC N 0 :M2014573的菌学特征为：该酵母菌是单细胞真核生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单 体，可在含有2mg/mL Zeocin抗生素的YPDS平板上培养，液体培养条件下以单细胞形式存 在，固体培养时。呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑、为乳白色。依次通过BMGY和BMMY培养 基培养后，上清液中含有大鲷虹彩病毒主衣壳蛋白部分结构蛋白。
[0013] 上述巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP 的构建方 法具体为：
[0014] 1)合成SEQ ID NO. 1所示为截断的MCP基因的核苷酸序列。
[0015] 2)引物设计
[0016] JDMCPIF :5' -CGGAATTCCGTATGACAACTTGG-3' (含 EcoR I 酶切位点）
[0017] JDMCP1R :5' -TCCCCGCGGCATTGTGCATAGGG-3' (含 Sac II 酶切位点）。
[0018] 3) PCR获取截断MCP基因
[0019] 以JDMCP1F/JDMCP1R为引物，合成的的截断MCP基因为模板进行PCR，回收PCR产 物。
[0020] 4)将获取的目的基因克隆入pPICZa B表达载体并进行序列测定
[0021] PCR产物和pPICZa B均用EcoR I、Sac II双酶切，T4DNA连接酶连接，连接产物 转化E. coli DH5a感受态细胞，从含25 μ g/mL Zeocin的LB平板上挑取单克隆，小量 提取质粒，用酵母特异引物 5' -AOX (5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'）和 3' -AOX (5' -GCA AATGGCATTCTGACATCC-3'）进行PCR鉴定，同时进行Sac II单酶切，EcoR I、Sac II双酶切鉴 定。阳性连接产物命名为：pPICZ a B-GSIV-MCP。
[0022] 5)电转酵母菌及转化子的筛选
[0023] 重组质粒pPICZ a B-GSIV-MCP经Sac I酶切线性化后，异丙醇沉淀回收，同时酶切 空载体设为对照。酵母KM71感受态细胞的制备参考EasySelect Pichia expression kit user ma nual, Invitrogen。将10 μ L线性化的重组质粒（约6 μ g)与80 μ L酵母感受态细 胞混合，转移至预冷的0. 2cm电转杯中，置冰上5min，I. 5kV电击6. 8毫秒后，立即加入ImL 预冷的1111〇1/1山梨醇，301：复苏211，取菌液20(^1^涂布在含10(^8/1^26〇(^11的￥?05平 板上，30°C培养2?4天，直单克隆出现。
[0024] 从含有100 μ g/mL Zeocin的YPDS抗性平板上随机挑取单克隆，按酵母基因组DNA 提取试剂盒（OMEGA)操作说明提取重组酵母DNA进行PCR鉴定，所用引物为酵母通用引物 AOX I。对鉴定后的重组酵母-80°C保存，对鉴定后的重组酵母_80°C保存。
[0025] 转化子高拷贝筛选：取出冻存的阳性转化子，在无抗性的YH)液体培养中活化。将 200 μ L菌液涂布于Zeocin抗生素浓度逐渐升高（0· 5mg/mL，lmg/mL和2mg/mL)的YPDS平 板上，30°C培养2?5d，每天观察菌落生长情况。挑取在高浓度平板上生长较快且颗粒饱 满的单克隆在YH)平板上划线纯化，即得重组毕赤酵母表达菌，该菌株已于2014年11月 18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO :M2014573,分类命名：巴斯德毕 赤酵母Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP，地址：中国武汉武汉大学。6)重 组酵母菌的诱导表达及产物鉴定
[0026] 将毕赤酵母Km71/GSIV-MCP接种到IOOmL BMGY培养基中，30°C、250r/min振荡培 养至OD6c?值达6左右，室温1500g离心5min，20mL BMMY培养基重悬菌体，所得菌液转入 IOOmL的摇瓶，封瓶膜封口，加入100%甲醇至终浓度0. 5%，于30°C、250r/min的条件下诱 导培养，每24h补加甲醇，使甲醇浓度维持0. 5%。连续诱导3天后，通过离心去除诱导液中 的酵母菌（去除沉淀，留上清），上清经过低温冷冻干燥和his纯化的方式进行浓缩纯化，即 得大鲷虹彩病毒病疫苗重组蛋白JDMCP，蛋白序列为SEQ ID NO. 2所示。
[0027] -种大鲷虹彩病毒病疫苗在制备大鲷虹彩病毒疫苗中的应用，将该疫苗直接注射 于大鲷体内，可起到抗大鲷虹彩病毒的效果。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0029] 1.毕赤酵母曾作为单细胞蛋白广泛应用，本身就具有很好的安全性，并且酵母培 养基中不含有毒物质和致热源；
[0030] 2.本发明生产的疫苗抗原是中和性抗原蛋白，而不是灭活或者减毒的大鲷虹彩病 毒，因此该疫苗安全可靠；
[0031] 3.本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质，与其他新型疫苗（如活载体疫苗、核酸疫 苗、基因缺失疫苗）相比不会发生可能出现的基因重组问题，因此本发明不存在生物安全 性问题。
[0032] 4.本发明以酵母作为目的蛋白的表达载体，培养简单，可以用发酵罐规模化生产， 可以实现质量控制，保证所生产的疫苗安全有效；
[0033] 5.本发明以酵母作为目的蛋白的表达载体，与大肠杆菌原核表达相比，表达量要 高，其活性要远高于包涵体蛋白。酵母表达系统是一种简单的真核表达系统，能稳定高效表 达外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目 的蛋白的工业化生产提供了保障，因此采用大鲷虹彩病毒主衣壳蛋白为亚单位疫苗可以完 全克服现有技术的不足，其使用较现有技术更为安全；
[0034] 6.质粒pPICZa B表达产物带有his标签，便于蛋白浓缩纯化；
[0035] 7.毕赤酵母具有高效的蛋白分泌系统。我们采用酵母的α因子信号肽序列将表 达的截断MCP蛋白直接分泌到培养基中。这样将大大简化蛋白的纯化工艺，降低疫苗的生 产成本；
[0036] 8.本发明在不减弱大鲷虹彩病毒主衣壳蛋白免疫原性的情况下，截短大鲷虹彩病 毒主衣壳蛋白基因，并按酵母密码子偏好性，重新编码基因，有利于重组蛋白大量表达；
[0037] 9.本发明所表达的目的蛋白，可直接用于制备大鲷虹彩病毒主衣壳蛋白单克隆抗 体的抗原。
【具体实施方式】
[0038] 本发明使用的材料及试剂如下，如未特别提出的材料，均为市售购得：
[0039] 本发明所提供的重组毕赤酵母菌株，为巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV_MCP Pichia pastori s Km71/GSIV-MCP菌株，已于2014年11月18日送至中国典型培养物包藏中心 保藏，保藏号：CCTCC NO :M2014573,分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris K m71/GSIV_MCP，地址：中国武汉武汉大学。
[0040] 表达菌：KM71、GS115、X33为目的基因表达的酵母菌，用于质粒转化时须经山梨醇 处理使其具有感受性，成为感受态细胞；大肠杆菌DH5ci，两菌株可以从Invitrogen公司购 买得到。
[0041] pCR 2. 1载体：为克隆载体，购自Invitrogen公司。
[0042] pPICZ a B载体：为酵母表达载体，购自Invitrogen公司。
[0043] 限制性内切酶EcoR I、Sac II、Sac I以及DNA连接酶购自Promega公司；Taq DNA 聚合酶、IOXPCR Buffer、dNTPs、DNA marker为TaKaRa公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试 剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒及酵母DNA提取试剂盒为OMEGA Bio-Tek公司产品；YNB和 Zeocin? 为 Invitrogen 公司产品；胰蛋白胨（Tryptone)、酵母提取物（Yeast extra ct)、 低熔点琼脂糖购均自Sigma公司；其余试剂为国产或进口分析纯试剂。
[0044] 主要试剂配制：
[0045] (I) IOXD (20% D-葡萄糖）：200g D-葡萄糖溶于IOOOmL水中，过滤除菌。
[0046] (2) 500 XB (0.02%生物素）：20mg生物素溶于IOOmL水中，过滤除菌，存于4°C。
[0047] (3)10XM(5%甲醇）：5mL甲醇与95mL水混匀后，过滤除菌，存于4°C。
[0048] (4)10XGY(10%甘油）：100mL甘油与900mL水混匀后，高压灭菌20min，室温放 置。
[0049] (5) IM磷酸钾缓冲液（pH 6. 0) :132mL IM K2HP04,868mL IM KH2PO4,用磷酸或KO H 调整pH值为6.0 ±0.1。过滤除菌，室温保存。
[0050] (6)10ΧΥΝΒ(13·4%酵母氮源碱）：134g YNB溶解于IOOOmL水中，过滤除菌，加热 至Y NB完全溶解，存于4°C。
[0051] (7) LB培养基：IOg胰蛋白胨，5g酵母浸出物，IOg氯化钠（制备平板时加入20g琼 脂粉），溶于ddH20, lmol/L NaOH调pH值至7. 0-7. 5,定容至lOOOmL，121°C高压下蒸气灭菌 20min，4°C保存备用。
[0052] (8)Yro培养基：酵母粉10g，胰蛋白胨20g溶于900mLddH20中（制作平板时加入 2(^琼脂粉），1211：高压灭菌201^11，冷却至601：左右加入10\0溶液1001^。
[0053] (9)81^液体培养基：1(^酵母粉，2(^蛋白胨溶于70〇1^水中，高压灭菌2〇11^11，冷 至室温后加入 IOOmL IM 磷酸钾缓冲液、IOOmL 10XYNB、2mL 500XB、100mL 10XGY，4°C可 保存2个月。
[0054] (10) BMMY液体培养基：加入IOOmL 10 XM取代IOOmL 10 X GY，其余同BMGY液体培 养基配置。
[0055] 实施例1 :
[0056] 截短优化的重组蛋白JDMCP的获得：
[0057] 1.截短区域筛选
[0058] 分析大鲷虹彩病毒MCP基因的抗原区、亲水区及表面展示概率，选取多段抗原决 定簇较集中且抗原性较强的亲水序列作为拟定表达基因。
[0059] 2.密码子优化
[0060] 根据酵母密码子偏好性，对拟定表达基因序列进行密码子优化，并且使GC含量保 持适中，对优化后的序列进行合成。优化后的MCP序列与原始序列（MCP)相比，序列中的 20% -30 %的碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换。
[0061] 3. MCP截短优化基因的扩增
[0062] 3. IMCP截短优化基因的PCR引物设计
[0063] 根据合成的MCP截短优化基因序列和酵母表达载体pPICZ a B所含的酶切位点，设 计特异扩增引物，分别引入EcoR I、Sac II酶切位点。
[0064] 3. 2PCR扩增截短优化MCP基因
[0065] PCR反应体系（50 μ L):截短优化MCP基因合成产物2 μ L，dNTP 1 μ L，引物各 1 μ L，T aq 酶 1 μ L，10 X Buffer 5 μ L，补 CldH2O 至总体积 50 μ L〇
[0066] ?0?反应条件：951：预变性51^11;941：变性2〇8,551：退火2〇8,721：延伸3〇8,30个 循环；最后72°C延伸lOmin。
[0067] 3. 3PCR产物的电泳检测及纯化
[0068] 1. 0%的琼脂糖凝胶检测截短优化MCP基因扩增产物，电泳完毕后置于Bio RAD凝 胶成像系统中，紫外光下拍照记录，产物的回收纯化。
[0069] 4截短优化MCP基因连接T载体
[0070] 将回收的截短优化MCP基因分别连接到pCR 2.1载体，反应体系（总体积为 1(^1^):14 1^卩〇?2.1载体、2 4 1^回收的核酸片段、5 4 1^(1(1!120、14 1^10\1^8&86 811打61·、 IyL T4DN A Ligase。充分混匀后，16°C低温水浴槽中连接过夜。转化大肠杆菌感受态细 胞后过夜培养，菌落PCR方法检测目的片段是否连接到载体pCR 2. 1上。
[0071] 5截短优化MCP基因酵母表达载体的构建
[0072] 5. 1目的片段和酵母表达载体的双酶切
[0073] 用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，然后用EcoR I和Sac II双酶切重组质粒和 酵母表达载体pPICZ α B，1. 0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。采用胶回收试剂盒分别回收 目的DNA片段和载体。
[0074] 5. 2截短优化MCP基因和酵母载体的连接、转化和鉴定
[0075] 回收的截短优化MCP基因片段与载体pPICZaB按摩尔比3:1的比例用T4DNA连 接酶进行体外连接（体系如下），用连接产物转化E. coli DH5 a感受态细胞，从含25 μ g/ mL Zeo cin的LB平板上挑取单克隆，小量提取质粒，用酵母特异引物AOX I进行PCR鉴定， 同时进行Sac II单酶切，EcoR I、Sac II双酶切鉴定。
[0076] 连接反应体系（10 μ L):
[0077]
【权利要求】
1. 一种分离的基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示。
2. 含有权利要求1所述基因的毕赤酵母。
3. -种基因工程菌，其特征在于：巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCP PicAia paWoris Km71/GSIV-MCP, CCTCC NO ：M2014573〇
4. 一种制备大鲷虹彩病毒病疫苗的方法，具体如下： 将巴斯德毕赤酵母 Km71/GSIV-MCP PicAia paWoris Km71/GSIV-MCP 接种到 100mL BMGY培养基中，30°C、250r/min振荡培养至0D_值达6左右，室温1500g离心5 min，20mL BMMY培养基重悬菌体，所得菌液转入100mL的摇瓶，封瓶膜封口，加入100%甲醇至终浓度 0. 5%，于30°C、250r/min的条件下诱导培养，每24h补加甲醇，使甲醇浓度维持0. 5% ; 连续诱导3天后，通过离心去除诱导液中的酵母菌，上清经过低温冷冻干燥和his纯化 的方式进行浓缩纯化，即得大鲷虹彩病毒病疫苗，该疫苗为纯化的蛋白，蛋白序列为SEQ ID NO. 2所示。
5. 权利要求3所述的菌株在制备大鲷虹彩病毒病疫苗中的应用。
6. 权利要求1所述基因编码的蛋白在制备大鲷虹彩病毒病疫苗中的应用。
【文档编号】C12N1/19GK104404057SQ201410728186
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】周勇, 曾令兵, 范玉顶, 徐进, 马杰 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所