新的耳聋相关基因突变多位点检测体系及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的耳聋相关基因突变检测体系，通过使用多重PCR引物及检测探针检测耳聋基因突变位点中是否存在突变，所述耳聋基因突变位点包括46个耳聋基因突变位点。本发明通过对现有多重核酸分子扩增技术加以改进，设计特定的检测探针，设置特定的检测体系组分和反应条件，以同时对常染色体上3个基因，X染色体上的一个基因和线粒体基因上的共46个突变位点进行快速检测，这些位点在临床和科研工作中积累的大量数据整理得出，除非综合型耳聋外还可检测常见的Alport综合征，与市面已有的同类检测产品相比该试剂盒能同时检测更多综合性/非综合性耳聋的相关基因突变位点，检测可在一个工作日内完成，最低仅需20－30纳克的DNA即可得到准确的检测结果。
【专利说明】新的耳聋相关基因突变多位点检测体系及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及遗传性耳聋分子检测领域的一种基因突变检测体系，具体而言，涉及 一种新的耳聋相关基因突变检测体系及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 耳聋是一种常见的临床疾病，主要与遗传因素及环境因素密切相关，即可能是由 相关基因突变引起，也可能是由环境暴露、创伤、药物等引起。据报道对于新生儿的先天性 耳聋50% - 60%是遗传因素导致，在相关报道的先天性病例中，有约70%属于非综合征性 耳聋。此类病例又可分为常染色体显性、常染色体隐性、性连锁和线粒体遗传性耳聋四类， 已有报道的耳聋相关位点多达数百个。
[0003]目前针对遗传性耳聋检测诊断方法，较普遍使用是检测病人耳聋相关的基因是否 存在缺陷，涉及到DNA检测的相关技术应用。常用的检测技术包括：限制酶切指纹一单链构 象多态性分析、限制性片段长度多态性分析、变性高效液相色谱分析、基因芯片、飞行时间 质谱、外显子捕获技术、直接测序等技术，以上各种检测技术各存优缺点。
[0004] 限制酶切指纹一单链构象多态性分析是用限制性核酸内切酶切割目标基因的PCR 扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测梅切产物，根据异常构象带进行目标基因有无突变的判断。 该方法最主要的问题是不能检测到所有的突变，由各实验室报道的突变检出率冲99%到 35%不等。同时该方法要求多次摸索条件，如电泳温度，胶中甘油浓度以及胶联度等均可影 响检测的灵敏度。此外，该方法也不能确定突变的精确位置。
[0005] 限制性片段长度多态性是用特定的限制性内切酶水解目标基因的PCR扩增产物， 然后分析酶解产物的电泳图谱特征，根据与正常对照的比对结果来判断待检样品是否存在 某个基因突变，其弱点操作繁琐，检出率低，因为并非所有的基因突变都恰好位于某个内切 酶的识别区。
[0006] 变性高效液相色谱分析此技术是一项在单链构象多态性分析和变性梯度凝胶电 泳基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术。它能对大批量PCR扩增产物进行筛查， 其在检测大量致病基因的不同序列方面显示出高度的敏感性，适合做快速的基因筛查。但 它也有一些不尽如人意之处：（1)它只是提供了定性的信息，而无法得出具体的突变类型 和突变位点。尚需测序等后续方法证实；（2)其结果判断通常是由操作者进行的，容易产生 观察差异，不利于各实验室之间的灵敏度比较；(3)许多片段有多个主要解链温度，需要筛 查的温度较多，增加的工作量。目前该技术主要用来检测200 - 300bp大小的DNA片段，长 的DNA片段的检测尚未见报道。
[0007] 基因芯片因其具有微型化、集约化、标准化和高通量的特点，在感染性疾病、遗传 性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势，可将对应于突变 热点的寡核苷酸探针合成点或点加于DNA芯片上，通过一次杂交完成对待测样品多种突变 可能性的筛查，实现对疾病的高效快速诊断，但芯片检测平台售价高昂，不利临床推广；现 有的临床耳聋基因检测芯片只检测9个突变位点，突变检出率较低。
[0008] 飞行时间质谱方法检测基因是首先进行PCR扩增目的片断区域，然后加入多对特 异性引物，进行单碱基延伸，再将单碱基延伸产物纯化后质谱分析，根据不同引物扩增产物 的质荷比不同，判断有无碱基突变。目前，深圳华大基因研究院通过飞行时间质谱和外显子 捕获两种检测方法检测耳聋基因。外显子捕获技术目前可以检测非综合征型耳聋的51个 基因和2个突变位点，和其他比较常见的综合征型耳聋，例如Alport综合征、Waardenburg 综合征等。市面常见的飞行时间质谱检测技术目前主要检测中国人群中高发的20个突变 位点，准确度高但只适用于大量样本的检测，对单个样本的检测费用较高。
[0009] 直接测序是将聚合酶链式反应扩增产物纯化、变性后，在测序仪上进行测序，为寻 找突变的金标准。但其仪器设备昂贵，且操作复杂、耗时较长。此外，杂合突变、胶压缩、GC 富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种新的耳聋相关基因突 变检测体系及试剂盒，筛选出46个临床上常见的耳聋相关基因检测位点，结合PCR等技术 设计和建立起一个高效准确快速的检测体系，实现在该体系内对46个耳聋基因突变位点 的同时快速检测。
[0011] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
[0012] 一种新的耳聋相关基因突变检测体系，通过使用多重PCR引物及检测探针检测耳 聋基因突变位点中是否存在突变，所述耳聋基因突变位点包括
[0013]
【权利要求】
1. 一种新的耳聋相关基因突变检测体系，其特征在于：通过使用多重PCR引物及检测 探针检测耳聋基因突变位点中是否存在突变，所述耳聋基因突变位点包括
共46个耳聋基因突变位点。
2. 根据权利要求1所述的耳聋相关基因突变检测体系，其特征在于，包括以下反应步 骤： 1) 将检测样本进行多重PCR反应； 2) 多重PCR产物纯化； 3) 分型连接反应； 4) 上样分析。
3. 根据权利要求2所述的耳聋相关基因突变检测体系，其特征在于：所述多重PCR反 应包括 待测DNA样本， 双蒸馏水， 2xGC I缓冲液， 2价镁离子溶液， 脱氧核糖核苷三磷酸， 引物混合液， 热稳定性的DNA聚合酶； 并进行PCR循环程序。
4. 根据权利要求3所述的耳聋相关基因突变检测体系，其特征在于：所述引物混合液 为23对多重PCR引物，所述的引物对的序列如SEQ ID NO. :1至SEQ ID NO. :46所示。
5. 根据权利要求3所述的耳聋相关基因突变检测体系，其特征在于：所述多重PCR产 物纯化为在PCR产物中加入1酶单位的SAP酶和1酶单位的Exonuclease I酶，温浴后灭 活。
6. 根据权利要求2所述的耳聋相关基因突变检测体系，其特征在于：所述分型连接反 应包括 多重PCR产物， IOx连接酶缓冲液， 4xGC溶液， Taq连接酶， 标记混合液， PiMLDR混合液， 双蒸馏水； 并进行循环反应。
7. 根据权利要求6所述的耳聋相关基因突变检测体系，其特征在于：所述PiMLDR混合 液为46组检测探针，每组检测探针包含2条鉴别探针及1条通用探针，所述的检测探针的 序列如 SEQ ID NO. :47 至 SEQ ID NO. :184 所示。
8. -种耳聋相关基因突变检试剂盒，其特征在于，包括： 双蒸馏水； 2xGC I缓冲液； 2价镁离子溶液； 脱氧核糖核苷三磷酸； 引物混合液； 热稳定性的DNA聚合酶； SAP 酶； Exonuclease I 酶； IOx连接酶缓冲液； 4xGC溶液； Taq连接酶； 标记混合液； PiMLDR混合液。
9. 根据权利要求8所述的耳聋相关基因突变检试剂盒，其特征在于：所述引物混合液 为23对多重PCR引物，所述的引物对的序列如SEQ ID NO. :1至SEQ ID NO. :46所示。
10. 根据权利要求8所述的耳聋相关基因突变检试剂盒，其特征在于：所述PiMLDR混 合液为46组检测探针，每组检测探针包含2条鉴别探针及1条通用探针，所述的检测探针 的序列如 SEQ ID NO. :47 至 SEQ ID NO. :184 所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104357578SQ201410728222
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】李海波, 刘德远, 李红, 姜正文 申请人:苏州市立医院, 天昊生物医药科技（苏州）有限公司