18] 含有nirK和nirS基因的标准质粒的获得：使用nirK和nirS基因引物对1和 2对沉积物样品DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为：10 X PCR Buf f er 1. 25 y 1，25mM MgCl20.75 yl，2.5mM dNTP 1.00yl，lyg/yl B SA 1.0〇41，1〇1^引物各0.25以1，模板 DNA 1. 00 y 1，Taq DNA 聚合酶 2. 5U，ddH20 补充到 12. 5 y 1。nirK 基因 PCR 扩增程序为： 95°C5min，95°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，35 个循环，最后 72°C lOmin。nirS 基因 PCR 扩 增程序为：94°C 5min，94°C lmin，57°C lmin，72°C lmin，35 个循环，最后 72°C lOmin。符合预 期大小的目的产物，无水乙醇沉淀过夜，用凝胶回收试剂盒对目的基因片段进行切胶纯化。 纯化产物与T载体16°C连接过夜，连接产物导入感受态细胞中，通过抗性筛选挑取含有目 的基因的单菌落。用小量质粒DNA提取试剂盒提取质粒样品，即获得用于qPCR扩增的含有 目的基因nirK和nirS的标准质粒。
[0019] 标准质粒的线性化：质粒使用Nde I限制性内切酶切过夜，使环状质粒线性化。在 Modulus多功能光度计上检测质粒浓度，并进行10倍浓度梯度稀释，制作标准质粒浓度梯 度标准品。
[0020] 标准质粒的拷贝数计算：使用Sanger法测定标准质粒中nirS和nirK的基因序 列，根据测序结果计算质粒分子量，并使用公式C = 6. 02X 1023XCQ/M(其中C为拷贝数；C。 为质粒浓度；M为含有目的基因质粒的分子量），计算质粒中目的基因nirS和nirK的拷贝 数。
[0021] 4、反硝化微生物nirK和nirS基因的实时荧光定量PCR
[0022] qPCR扩增：在Modulus多功能光度计上测定各个站位宏基因组DNA浓度，并将 所有站位样品DNA浓度调整到10ng/ y 1。样品DNA和标准质粒同时进行qPCR扩增，为 保证重复性和准确性，每个样品至少设置三个平行。nirK基因反应体系总体积为15 iil， 包括：2XSYBR Green Premix 7.5 yl，10 yM 引物各 0.3 yl，50XROX Reference Dye II 〇.3yl，模板 DNA l.Oyl，ddH20 补充到 15yl ;nirK 基因 qPCR 反应程序为：95°C 15min; 95°C 30s，60°C 35s，72°C 35s，80°C 45s，40个循环。80°C荧光取值，并进行熔解曲线的检 测。nirS基因反应总体积为20 yl，包括：2XSYBR Green Premix 10.0 yl，10 yM引物各 0. 4yl，50XR0X Reference Dye II 0.4yl，模板DNA 1.0yl，ddH20补充到20yl;nirS基 因9?〇?反应程序为：95°(：15111111 ;95°(：158,551€358,721€358,801€458,40个循环。80 1€ 荧光取值，并进行溶解曲线的检测。
[0023] 标准曲线的绘制：qPCR反应结束后，分别以不同浓度的标准质粒标准品拷贝数的 对数为横坐标，qPCR反应荧光阈值Ct值作为纵坐标，绘制标准曲线。得到的nirK和nirS 基因qPCR的标准曲线分别见图1和图2。
[0024] 反硝化微生物nirK和nirS基因拷贝数的计算：根据标准曲线和样品的Ct值计算 样品中反硝化微生物nirK和nirS基因的拷贝数，实现对反硝化微生物的定量。
[0025] 本发明相对于现有技术的优点及效果：
[0026] 1、本发明不依赖微生物富集培养技术，时间短、效果好。
[0027] 2、本发明以亚硝酸盐还原酶功能基因nirS和nirK作为分子标记，首次建立了对 水产养殖环境中反硝化微生物全面、准确、灵敏的分子生物学定量检测手段。鉴于nirK和 nirS基因虽然功能相同，但是结构不同，特别是不能同时存在于同一细胞内，如果单独检测 某一种基因，不能得到反硝化微生物全面完整的信息。本发明同时检测nirK和nirS基因， 得到的反硝化微生物数量信息更加全面准确。
[0028] 3、本发明的实施中，nirK基因标准曲线回归系数为0. 998,斜率为-3. 4611(扩 增效率为0. 95) ;nirS基因标准曲线的回归系数为0. 993,斜率为-3. 2621 (扩增效率为 1. 026)，说明本发明对于检测不同类型的反硝化微生物有很好的重复性。
[0029] 4、
【附图说明】：
[0030] 图1是nirK基因荧光定量PCR的标准曲线图
[0031] 图2是nirS基因荧光定量PCR的标准曲线图
【具体实施方式】：
[0032] 1、宏基因组DNA的提取
[0033] 称取0. 3g养殖水环境沉积物样品，加入到裂解反应管中，向管中加入1100 y 1裂 解缓冲液。将裂解反应管放入核酸提取仪中，设定速度4.5,时间30s，进行裂解。离心管 4°C，13000rpm离心15min。上清用切头枪头移入到新的2ml离心管中，加入250 yl蛋白沉 淀缓冲液，轻柔颠倒10次混勾，4°C，13000rpm离心5min。用切头枪头将上清移入两个新的 离心管中，悬浮液摇匀使其悬浮，每个离心管加入500 y 1的悬浮液。轻轻颠倒混匀2min，离 心管放于管架4°C静置3min。每管吸出300 y 1上清丢弃，轻柔混匀上清和悬浮液。混合液 移入纯化柱中4°C，llOOOrpm离心lmin，倒掉废液。向纯化柱中加入500 y 1已加入无水乙 醇的洗涤缓冲液，4°C，llOOOrpm离心lmin，倒掉废液，重复三次，4°C，llOOOrpm离心2min。 纯化柱放入新的1. 5ml离心管中，室温干燥5min。纯化柱中加入50 y 1 DNA溶解缓冲液， 55°C水浴6min，4°C，llOOOrpm离心lmin，再加40 y 1重复上述步骤，得到待测样品的宏基因 组DNA。产物使用0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳检测，然后保存在-80 °C冰箱。
[0034] 2、特异性引物的确定
[0035] 目前，针对nirK和nirS基因设计的特异性引物有很多，如nirK基因特异性引 物：FlaCu/R3Cu、FlaCu/nirK3R、FlaCu/nirK5R、nirKlF/R3Cu、nirKlF/nirK3R、nirKlF/ nirK5R 等；nirS 基因特异性引物：cd3aF/R3cd、cd3aF/R4cd、cd3aF/nirS4R、cd3aF/nirS6R、 nirSlF/R3cd、nirSlF/nirS6R、nirSlF/nirS4R、nirS3F/nirS6R 等，这些引物分别匹配基因 的不同保守位点，并且扩增出来的基因片段大小不同。在选择引物时，考虑到所研究的水产 养殖环境中硝酸根、亚硝酸根等含量偏高的特点，并且已报道的反硝化微生物绝大部分属 于变形细菌、假单胞菌、产碱杆菌、微球菌等菌属。我们经过试验后，最终确定了扩增nirK 基因的引物为FlaCu/R3Cu，扩增nirS基因的引物为cd3aF/R3cd。
[0036] 3、标准质粒的构建
[0037] 含有nirK和nirS基因标准质粒的获得：使用反硝化微生物亚硝酸盐还原酶nirK 和nirS基因对应的引物对样品DNA进行PCR扩增。PCR反应在PCR管中进行，总体积为 12. 5 iil。扩增体系如下表中所示：
[0038]
[0039] nirK基因 PCR反应程序为：95°C 5min，95°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，35 个循环， 最后 72°C lOmin。nirS 基因 PCR 反应程序为：94°C 5min，94°C lmin，57°C lmin，72°C lmin， 35个循环，最后72°C lOmin。符合预期大小的目的产物，无水乙醇沉淀过夜，用凝胶回收试 剂盒对符合预期大小的目的基因进行切胶纯化，其中nirK基因片段大小约为490bp，nirS 基因片段大小约为420bp。纯化产物与载体pMD19-T在16°C连接过夜，连接产物使用42°C 热激法导入大肠杆菌DH 5 a感受态细胞中，将菌液涂布于含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的 LB固体培养基上，37°C培养过夜，低温显色。挑取白色单个菌落，接种到含有氨苄青霉素的 5ml LB液体试管中，37°C培养过夜。用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒DNA，即获得用于 qPCR扩增的含有目的基因nirK和nirS的标准质粒。
[0040] 标准质粒的线性化：质粒使用Nde I限制性内切酶切过夜，酶切后的环状质粒线 性化为线性质粒。在Modulus多功能光度计上检测质粒浓度，并对线性化后的质粒进行10 倍浓度梯度稀释，制作浓度梯度标准品。
[0041] 标准质粒的拷贝数计算：测定标准质粒中nirS和nirK的基因序列，根据测序结果 的序列信息，计算质粒分子量，并使用以下公式计算质粒中nirS和nirK基因的拷贝数。
[0042] C = 6. 02X 1023XC〇/M