约3mm。两线距离5 ~8mm，均勾。37 °C烘干，封装备用。
[0061 ] 2、胶体金、金标记单克隆抗体的制备。
[0062] (1)溶液的配制。
[0063] ①氯金酸的配制：用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1 %溶液，置4°C备用，有效期 四个月。l〇〇〇mL 1%氯金酸溶液配方:10g氯金酸:双蒸去离子水定容至1000mL。
[0064] ②柠檬酸三钠的配制：用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠，配成1 %溶液，0.22μπι膜滤 过，置4度备用，有效期容至1000mL。
[0065] ③0.1M碳酸钾的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μπι膜滤过，置4度备用，有效期四 个月。lOOOmLO. 1Μ碳酸钾溶液配方:13.8g碳酸钾;双蒸去离子水定容至1000mL。
[0066] ④2 %PEG-20000的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μπι膜滤过，置4度备用，有效期 四个月。1000mL 2%PEG-20000溶液配方:20g PEG-20000;双蒸去离子水定容至1000mL。
[0067] ⑤标记洗涤保存液的配制：2%牛血清白蛋白（BSA)，0.05%叠氮钠(NaN3)，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μπι膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1 OOOrnL标记洗涤保存液配方:20g BSA，0.5g NaN3、0.01M pH7.2PBS溶液定容至 1000mL。
[0068] (2)胶体金的制备：
[0069]用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%，置电炉煮沸，按每100mL 0.01%氯金 酸加入2mL 1%柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足 失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。
[0070] (3)胶体金标记单克隆抗体的制备：
[0071 ]用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按8~10yg抗体/ml胶体金加入实施例1中制 备得到的单克隆抗体7P1-11，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1%静置1 小时。13000rpm、4 °C离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始 胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4°C备用，有效期一周。
[0072] 3、金标垫的制备。
[0073] (1)封闭液的配制：
[0074] 2%BSA，0 · 1 %TritonX-100、0 · 05%NaN3，0 · 01M pH7 · 2PBS溶液，0 · 22μπι膜滤过，置 4度备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方:20g BSA，0.5g NaN3、lmL TritonX-100、0.01M PH7.2PBS溶液定容至lOOOmL。
[0075] (2)金标垫的制备：
[0076]将金标垫浸泡于封闭液中30min后好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升 溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4 °C备用。
[0077] 4、试纸条样品垫的制备。
[0078] (1)封闭液的配制：
[0079] 2%BSA，0 · 1 %TrtionX-100、0 · 05%NaN3，0 · 01M pH7 · 2PBS溶液，0 · 22μπι膜滤过，置 4度备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方:20g BSA，0.5g NaN3、lmL TrtionX-100、0.01M PH7.2PBS溶液定容至1000mL。
[0080] (2)样品塾的制备：
[0081] 将样品垫浸泡于封闭液中30min后，于37°C烘干，封装，置4°C备用。
[0082] 5、试纸条的组装。
[0083]将吸收垫(购自Millipore公司）、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次层叠设置在 不吸水的支撑薄片上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装，得到所述 检测试纸。
[0084] 实施例3
[0085] 检测EV71病毒VP1蛋白的试剂盒。
[0086] 1、快速检测EV71病毒VP 1蛋白的试剂盒包括:实施例2制作的检测试纸及样品稀释 液。
[0087] 样品稀释液为8%NaCl溶液。配制方法:80gNaCl，加蒸馏水定容至1000ml。
[0088] 2、胶体金法检测EV71病毒VP1蛋白。
[0089] (1)直接吸取120μ1采集好的人血清或血浆加入到试纸卡加样孔，等待15min后即 可观察结果。
[0090] (2)结果判定：当试纸条出现肉眼可见的红色质控线，没有出现肉眼可见的红色检 测线，结果判为阴性；当试纸条出现肉眼可见的红色质控线，同时也出现肉眼可见的红色检 测线，结果判为阳性。检测线颜色越深说明被检测样品的EV71病毒VP1蛋白水平越高。当试 纸条没有出现肉眼可见的紫红色质控线，不管有没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果 都判为检测试纸条失效，应废弃。
[0091] 实施例4
[0092] EV71病毒VP1抗原胶体金快速检测试纸试剂盒的应用。
[0093] 以Suoaobio肠道病毒71型/柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)双色荧光检测试剂盒检 出的EV71阳性样本，CA16阳性样本，以及EV71/CA16双阴性样本作为本试剂盒的检测样本， 其中126例检出EV71阳性样本，43例检出CA16阳性样本，500例阴性标本。采用本专利发明的 EV71病毒VP1抗原胶体金试剂盒检测上述126份EV71阳性样本，43份CA16阳性样本和500份 阴性样本，检出结果见表1。
[0094]表1:实施例3的EV71病毒VP1抗原检测试剂盒的检测结果
[0095]
[0096] 由表1可以看出，本实施例的EV71病毒VP1抗原胶体金快速检测试纸试剂盒检出 EV71阳性标本117份，相对灵敏度为92.68%;0416标本未检出，相对特异性为100%，500份 阴性样本检出500份，相对特异性为100 %。该结果与Suoaobio肠道病毒71型/柯萨奇病毒 八16型化￥71/^416)双色荧光检测试剂盒的结果符合率为98.65%。
[0097]由此说明，本实施例的EV71病毒VP1抗原胶体金快速检测试纸试剂盒可以用于 EV71型肠道病毒早期分型快速诊断。
[0098]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，保藏号为 CCTCC No：C2015225〇2. 如权利要求1所述的杂交瘤细胞在制备EV71病毒检测试剂或EV71病毒检测设备中的 应用。3. 如权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体，其特征在 于，所述抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体记为7P1-7。4. 一种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，保藏号为 CCTCC No：C2015226〇5. 如权利要求4所述的抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体在制备EV71病毒检测试剂或检 测设备中的应用。6. 如权利要求4所述的杂交瘤细胞分泌的抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体，其特征在 于，所述抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体记为7P1-11。7. -种EV71病毒检测试纸，其特征在于，包括如权利要求3所述的7P1-7和如权利要求6 所述的7P1-11。8. 如权利要求7所述的EV71病毒检测试纸，其特征在于，包括支撑薄片、样品垫、金标 垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜 及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与 所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所 述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设 在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有 7P1-7包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的单克隆抗体，所述检测线为7P1-11，所述质控线 为羊抗鼠 IgG抗体。9. 一种EV71病毒检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求7或8所述的EV71病毒检测 试纸。
【专利摘要】本发明涉及一种灵敏度较高且特异性较强的EV71病毒检测试纸，该EV71病毒检测试纸通过使用杂交瘤细胞分泌的抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体，在标记物为较大的纳米颗粒时，间接标记可以降低标记抗原的使用量，在提高灵敏度的同时改善特异性。此外，本发明还涉及一种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。该杂交瘤细胞为两株，保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号是CCTCC？No：C2015225和CCTCC？No：C2015226。CCTCC No：C201522520151217
【IPC分类】G01N33/569, G01N33/577, C07K16/10, C12N5/20
【公开号】CN105567643
【申请号】CN201511005121
【发明人】李泓彦, 李凡
【申请人】菲鹏生物股份有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月28日