子区和ATG起始密码子。在腺瘤和结直肠癌中该区域呈现出不同的甲基化状况：在结直肠 癌中甲基化是从CGI3的核屯、区延伸到5'端，而在腺瘤中，CGI3的5'端未发生甲基化，运 可能说明甲基化范围的扩大是由腺瘤发展为结直肠癌进程中的晚期事件。运种CGI3核屯、 区域的甲基化形式的区别可能代表着甲基化状况的转换，反应了结直肠粘膜恶化的细胞进 程。CGI3区域的超甲基化可能抑制SEPT9_V2转录本的正常表达，进而扰乱结构纤丝的形成 和关键的细胞功能。
[0014] 在细胞调亡、坏死和增殖过程中，细胞内DNA会释放或分泌岛循环血液当中成为 游离循环DNA(cfcDNA)。其含量被发现在癌症患者的血清中有所升高。测量血清中cfcDNA 来作为肿瘤标志物的尝试都因血清中异常的cfcDNA浓度的不稳定性及其含量易受创伤、 炎症、中风、甚至剧烈运动等多种因素的影响而未能成功。直到CfcDNA中肿瘤特异的突变 被发现，基于突变分析的肿瘤早期诊断才成为可能。将CfcDNA突变检测变成一项真正的诊 断产品存在一些障碍，如：在疾病发展的早期突变序列的低含量；无法透过突变检测指示 肿瘤的位置W及突变检测本身的技术难题。不过，肿瘤特异的碱基突变不是CfcDNA携带的 唯一的序列信息。表观遗传学信息，如某些富含GC序列的片段的DNA甲基化也能从cfcDNA 的检测分析中获得。
[0015] 一种CfcDNA甲基化标记要成为一种疾病筛查或诊断产品需要满足几个条件，首 先，该cfcDNA标记物在血清中的含量要足够持续稳定且可被检测到。第二，该标志物应具 有独特、稳定的甲基化模式，W便于检出并区别于其他疾病相关的甲基化。第Ξ，该标记敏 感性和特异性必须优化到能区分肿瘤的甲基化状态和正常组织的甲基化状态。第四，该标 记的水平不受感染、怀孕、其他肿瘤和消炎药物等干扰因素的影响。最后，测试本身应具有 可操作性，可分析性，简单，和便捷等特点。
[0016] 过去5年的多个病例对照研究中证实了在结直肠癌早期检测中外周血游离DM的 SEPT9基因甲基化检测表现出稳定的高敏感性化7-79. 3% )和高特异性（86-99% )，由此 可见，检测游离DNA的SEPT9甲基化情况可W作为结直肠癌早期诊断一个较好的分子指标。
[0017] 目前检测甲基化的方法主要有W下几种：
[0018] (1)直接测序法化isulfitesequencingPCR、BSP)。直接测序法的原理是：重亚硫 酸盐使DNA中未发生甲基化的胞喀晚脱氨基转变成尿喀晚，而甲基化的胞喀晚保持不变， PCR扩增后，尿喀晚全部转化成胸腺喀晚，最后对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列 比较，判断CpG位点是否发生甲基化。该实验方法首先需要进行引物设计（每个基因设计 一对引物，引物位置尽可能的避开DNA中的CG位点），随后需要对目的条带进行切胶回收； 回收后的PCR产物连接克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。但此方法实 验过程长，需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，实验检测的费用高。
[0019] (2)甲基化特异性PCR法（MethylmionSpecificPCR、MSP)。该方法为用重亚硫 酸盐使胞喀晚转化为尿喀晚，进行引物设计（每个基因设计两对引物，分别为：甲基化引物 M、非基因化引物U，对应扩增甲基化和非甲基化的目的片段），有时需设计巢式引物；PCR扩 增：对甲基化和非甲基化的目的片段分别进行扩增，此时应尽可能使用梯度PCR仪，同时使 用不同的退火溫度，W筛选到合适的退火溫度；对PCR产物电泳。该方法检测时间相对较 长，不能及时获得检测结果。
[0020] (3)甲基化敏感性解链曲线分析法（MS-Hi曲Resolution Melting Qirve、 MS-HRM)。该方法利用经亚硫酸氨盐处理（修饰）后的甲基化DNA与非甲基化DNA之间的 碱基差异，结合碱基变化会引起产物烙解溫度变化及烙解曲线差异W及在反应结束后热变 性烙解曲线图明显不同的原理，结合梯度甲基化标准品，可绘制标准梯度曲线。对比待检样 品的热变性曲线在标准曲线中的区域，即可得出该样品的甲基化水平区间。该方法需要不 同甲基化程度的标准品，实验结果读取复杂繁琐。并且该方法用的巧光染料为饱和巧光染 料，结果只能检测一个巧光信号通道，不能同时分析样本内参基因的扩增情况，不能推断硫 化修饰的效果，容易出现重亚硫酸盐处理不完全的问题W及假阴性。
[0021] (4)甲基化敏感性限制性内切酶（methylation-sensitiverestrictionlindonuc lease,MS-RE法）。运种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特 性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有 Hpall-MspI(识别序列CCGG)和Smal-Xmal(CCCGGG)等。由于后者识别的碱基数相对较多， 其碱基序列在体内出现的概率相对较低，所前者即化all-MspI更常用。其中化all 和MspI均能识别CCGG序列，然而当序列中的胞喀晚发生甲基化时，化all不切割，利用 化all-MspI的运种属性处理DNA，随后进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状 态。运是一种经典的甲基化研究方法，其优点是：相对简单，成本低廉，甲基化位点明确，实 验结果易解释；缺点是：1.由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽 略；2.只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义； 3.相对而言，Southern方法较复杂，且需要样本的量大；4.存在着酶不完全消化引起的假 阳性的问题点不适用于混合样本。
【发明内容】
[0022] 本发明旨在克服上述技术的不足，提供一种用于结直肠癌诊断的人外周血中循环 肿瘤DNA中septin9基因甲基化检测的试剂盒，。
[0023] 为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
[0024] 所述人外周血循环肿瘤DNA中septin9基因甲基化的检测试剂盒中包括： septin9基因目的位点的甲基化特异引物；septin9基因目的位点的非甲基化特异的双脱 氧胞巧修饰引物；septin9基因特异的水解探针；内参基因的引物和内参基因的水解探针； 所述septin9基因目的位点为septin9基因V2转录本丫 1外显子区所包含的至少一个CpG 位点；所述内参基因为GAPDH、e-actin、B2M、SDHA、HPRTl中的一种或者多种。
[00巧]优选地，所述septin9基因目的位点的甲基化特异引物（其终浓度为：0. 1~luM) 包括：
[0026]正向引物：5，-ggctcttgagcccacaggc-3'(沈QIDNO. 1);
[0027]反向引物：5, -tttgggcagccaaacaaagttctctgt-3'(沈QIDNO. 2);
[002引所述septin9基因目的位点非甲基化特异的双脱氧胞巧修饰引物（其终浓度为： 0. 1~luM)包括：
[0029]正向引物：5'-gactcttgaacccacagac-3'(SEQIDNO. 3)，所述正向引物的 3'端被 双
[0030] 脱氧胞巧修饰；
[0031]反向引物：5, -tttgggcagccaaacaaagttctctgt-3'(沈QIDNO. 4);
[0032] 所述septin9基因特异的水解探针（其终浓度为：0. 1~luM)为：
[0033] 5, -accgccgccgcgcgctcta-3'(沈QIDNO. 5)。
[0034] 优选地，所述内参基因的引物和内参基因的水解探针如下：
[0035]GATOH:
[0036]正向引物：5，-ttggaaaaggatatttttattgtaaaa-3，（沈QIDNO. 6);
[0037]反向引物：5, -aattccccaaaacacccaaacaccca-3，（沈QIDNO. 7);
[0038]探针：5，-ctaacctttaaaatcaaat-3'(沈QIDNO. 8);
[0039] β-actin：
[0040]正向引物：5, -taatttgtgtgtgtgttttggggtttg-3，（沈QIDNO. 9);
[0041]反向引物：5, -cctccacccaattcaaacaacaccaa-3'(沈QIDNO. 10);
[0042]探针：5，-aaatacacacaaacaccca-3，（沈QIDNO. 11);
[0043]B2M：
[0044]正向引物：5，-tttatttgattataatggaaagtatg