外周血中循环非血液细胞标识基因的检测与鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明设计用分子信标检测外周血中循环非血液细胞(外周血循环肿瘤细胞(CTC))，将选择合成CTC标识基因EP-CAM、CK基因的分子信标，与CTC细胞内的这些基因和mRNA杂交，而检测其基因和mRNA表达水平。通过(1)活细胞检测CTC标识基因或固定细胞检测CTC标识基因，从基因水平检测CTC；(2)再用化学染色法从病理形态学水平鉴定CTC。本方法具有准确(基因水平和细胞病理形态学检测鉴定细胞)、快速(1～3.5小时内报告结果)、经济(成本低)的优点。具有广阔的市场前景，将产生巨大的社会效益和经济效益。
【专利说明】外周血中循环非血液细胞标识基因的检测与鉴定
一、所属【技术领域】
[0001]本发明专利涉及外周血中循环非血液细胞的富集与标识基因的检测。适宜于外周血中循环非血液细胞(循环肿瘤细胞)内标识基因的检测。
二、【背景技术】
[0002]本方法所述外周血非循环血液细胞主要指外周血循环肿瘤细胞(CTC)。外周血循环癌细胞和癌细胞栓(团)标识基因的检测与鉴定，对于肿瘤的转移、肿瘤的复发、肿瘤化疗药物的敏感性测定、肿瘤的预后及早期诊断具有重要应用价值。本专利通过癌细胞特有的上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、细胞角蛋白(CK8、18、19等)等基因合成的分子灯标，通过细胞内分子，达到从基因水平检测肿瘤细胞标识基因、并通过化学染色从病理形态学水平检定CTC的目的。
[0003]目前，国内外还没有通过上述循环肿瘤细胞标志基因检测鉴定肿瘤细胞的报道。现有的方法是通过免疫荧光从免疫学方面和病理形态学方面检测鉴定CTC。
三、
【发明内容】
[0004]1、分子信标检测、鉴定CTC标志基因:循环肿瘤细胞含有EP-CAM、CK标识基因，本专利设计合成与EP-CAM、CK等基因和与其mRNA特异性杂交的分子信标，经细胞内分子杂交的方法检测鉴定CTC的标志基因及mRNA的表达水。荧光显微镜观察记录反应结果。
[0005]2、显微镜:将荧光显微镜观察的细胞片，用化学方法染色，用一般化学染色就能清晰的从病理形态学上鉴定肿瘤细胞。
[0006]四、要解决的技术问题
[0007]1、细胞内分子杂交从基因水平检测CTC:通过合成CTC标志基因的分子信标，采用细胞内分子杂交的方法，从基因水平检测鉴定CTC并分析其基因表达水平。
[0008]2、化学染色从病理形态学水平鉴定CTC:通过分子信标从基因水平检测CTC，在循环肿瘤细胞的检测，特别是癌症的早期筛查、癌转移或复发是非常重要的；再用化学染色从病理形态学角度鉴定癌细胞，是非常必要的。
四、【具体实施方式】
[0009](一 )实施例1、活细胞检测CTC标识基因
[0010]1、用抗凝管采集被检者全血8ml，混匀。
[0011]2、采用膜分离、磁分离、梯度离心等方法富集CTC。
[0012]3、用1640或其它细胞培养液在微孔板内培养CTC。
[0013]4、将稀释0.01-800nM EP-CAM、CK等的分子信标溶液加入微孔板内，370C?520C温浴杂交0.5?12小时。
[0014]5、用DAPI复染5?25分钟。
[0015]6、荧光显微镜观察荧光细胞:通过肿瘤细胞(CK、Ep_CAM)及DAPI的荧光颜色及形态分辨非血液性细胞(癌细胞)和白细胞。拍照、存档。
[0016]7、用化学染色剂复染细胞片5?40分钟，淋洗染液时注意不要直接淋洗细胞部位，水冲力要小。
[0017]8、用一般显微镜观察细胞病理学形态，尽可能和免疫荧光对边观察细胞。通过癌细胞特有的核大、核畸形、核浆比失调等特征，从病理形态学方面鉴定非血液细胞(癌细胞)。
[0018]( 二)实施例2、固定细胞检测CTC标识基因:
[0019]1、用抗凝管采集被检者全血8ml，混匀。
[0020]2、采用膜分离、磁分离、梯度离心等方法富集CTC。
[0021]3、用有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮等)或醛类(甲醛、多聚甲醛)固定细胞，5?30分钟。用醛类固定细胞，还要用曲拉通等试剂通透细胞，时间5?30分钟。用洗涤液洗涤I?5次。
[0022]4、用BSA或其它动物血清370C封闭10?60分钟。用洗涤液洗涤I?5次。
[0023]5、将稀释0.01-800nM EP-CAM、CK等的分子信标溶液加入微孔板内，370C?520C温浴杂交0.5?12小时。用洗涤液洗涤I?5次。
[0024]6、用DAPI复染5?25分钟。用洗涤液洗涤I?5次。
[0025]7、荧光显微镜观察荧光细胞:通过肿瘤细胞(CK、Ep_CAM)及DAPI的荧光颜色及形态分辨非血液性细胞(癌细胞)和白细胞。拍照、存档。
[0026]8、用化学染色剂(瑞姬氏染色液、瑞氏染色液等)复染细胞片5?40分钟，淋洗染液时注意不要直接淋洗细胞部位，水冲力要小。
[0027]9、用一般显微镜观察细胞病理学形态，尽可能和免疫荧光对边观察细胞。通过癌细胞特有的核大、核畸形、核浆比失调等特征，从病理形态学方面鉴定非血液细胞(癌细胞)。
[0028]5、用DAPI复染5?25分钟。
[0029]6、荧光显微镜观察荧光细胞:通过肿瘤细胞(CK、Ep_CAM)及DAPI的荧光颜色及形态分辨非血液性细胞(癌细胞)和白细胞。拍照、存档。
[0030]7、用化学染色剂复染细胞片5?40分钟，淋洗染液时注意不要直接淋洗细胞部位，水冲力要小。
[0031]8、用一般显微镜观察细胞病理学形态，尽可能和免疫荧光对边观察细胞。通过癌细胞特有的核大、核畸形、核浆比失调等特征，从病理形态学方面鉴定非血液细胞(癌细胞)。
[0032]( 二)实施例2、固定细胞检测CTC标识基因:
[0033]1、用抗凝管采集被检者全血8ml，混匀。
[0034]2、采用膜分离、磁分离、梯度离心等方法富集CTC。
[0035]3、用有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮等)或醛类(甲醛、多聚甲醛)固定细胞，5?30分钟。用醛类固定细胞，还要用曲拉通等试剂通透细胞，时间5?30分钟。用洗涤液洗涤I?5次。
[0036]4、用BSA或其它动物血清370C封闭10?60分钟。用洗涤液洗涤I?5次。
[0037]5、将稀释0.01-800nM EP-CAM、CK等的分子信标溶液加入微孔板内，370C?520C温浴杂交0.5?12小时。用洗涤液洗涤I?5次。
[0038]6、用DAPI复染5?25分钟。用洗涤液洗涤I?5次。
[0039]7、荧光显微镜观察荧光细胞:通过肿瘤细胞(CK、Ep_CAM)及DAPI的荧光颜色及形态分辨非血液性细胞(癌细胞)和白细胞。拍照、存档。
[0040]8、用化学染色剂(瑞姬氏染色液、瑞氏染色液等)复染细胞片5?40分钟，淋洗染液时注意不要直接淋洗细胞部位，水冲力要小。
[0041]9、用一般显微镜观察细胞病理学形态，尽可能和免疫荧光对边观察细胞。通过癌细胞特有的核大、核畸形、核浆比失调等特征，从病理形态学方面鉴定非血液细胞(癌细胞)。
【权利要求】
1.基于外周血中循环非血液细胞(循环肿瘤细胞(CTC))标识基因(EP-CAM、CK)，用分子信标方法从基因水平检测鉴定CTC。
2.活细胞检测CTC标识基因:分离富集CTC，加1640等培养液培养，加CTC标识基因的分子信标，杂交检测CTC细胞的标志基因，从基因水平检测CTC ;再用化学染色从病理形态学水平鉴定CTC。
3.固定细胞检测CTC标识基因:分离富集CTC，用有机溶剂固定细胞，加CTC标识基因的分子信标，杂交检测CTC细胞的标志基因，从基因水平检测CTC ;再用化学染色从病理形态学水平鉴定C TC。
【文档编号】G01N21/29GK103901002SQ201210576618
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2012年12月27日
【发明者】肖乐义, 骆云连, 米明仁, 李静静, 李璐, 马小丽, 李薇, 谭印成, 王秀丽, 王津津, 张志立, 陈凤华, 韩峰, 郑玉芬 申请人:河北燕达医学研究院