专利名称：一种鉴别银杏叶制剂中原花青素的方法
技术领域：
本发明涉及用于分析和鉴别分析物或待分析样本中含有原花青素的方法，具体为银杏叶制剂中是否有掺假其他来源原花青素的鉴别方法。
背景技术：
银杏是目前世界上存活的最古老的树种之一，其制剂、保健食品已经成为当今世界市场上最热门的植物产品之一。银杏叶提取物的药用价值很高，具有拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎、抗过敏、扩张血管、保护心脑血管、改善外周血液循环、降低血清胆固
醇及辅助抗癌等多种药理学活性。银杏内酯和黄酮是产生上述药理学活性的主要成分，也是银杏叶提取物的主要有效成分和质量控制指标。近年研究发现了银杏中含原花青素，其同样具有广泛的药理学活性，是银杏叶制剂产生疗效的又一主要成分。原花青素是一类由若干个儿茶素类化合物聚合而成，具有黄烷-3-醇结构的植物多酹类化合物。原花青素在自然界中有多种亚型，包括Propelargonidin (单体为阿夫儿茶精和表阿夫儿茶精)、Procyanidin (单体为儿茶素和表儿茶素)、Prodelphinidin(单体为没食子儿茶素和表没食子儿茶素)、Profisetinidin (单体为非瑟酮醇和表非瑟酮醇)、Prorobinetinidin (单体为洋槐儿茶精和表洋槐儿茶精)。不同植物中的原花青素，其单体组成及比例都是不同的。大部分植物原花青素以儿茶素和表儿茶素组成的Procyanidin为主。而银杏原花青素则主要由没食子儿茶素和表没食子儿茶素组成，即Prodelphinidin,其比例高达85%。到目前为止,Prodelphinidin仅发现存在于美国山核桃(Carya illionensis)的髓心及银杏叶中。用于分析原花青素的方法有很多，曾有学者应用正相-高效液相色谱法将可可、草莓的原花青素按聚合度大小进行分离，这是一种有效的分析原花青素组成的手段。但目前，银杏原花青素的研究仍处于起步阶段，对银杏叶制剂中原花青素的分析，包括定性和定量分析，均没有文献报道。由于现在国家银杏叶制剂产品的检测标准较低，造成了有不法商人用别的低价产品掺入银杏中制剂产品中，制备出检测合格的银杏叶制剂假货，危害到人民群众的用药安全，危险性极大。目前对银杏黄酮的检测已有专属方法，但其要求较高，应用受限。而银杏叶制剂中原花青素的真假鉴别未见相关报道，因此在检测方面是一个空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于分析银杏叶制剂中原花青素的方法，该方法能去除绝大多数杂质的干扰，快速将银杏叶原花青素按聚合度的大小进行分离，并根据不同来源原花青素图谱的不同，用于鉴别银杏制剂中有没有掺假。本发明人在对银杏叶制剂中原花青素研究时发现，虽然多种植物中都含有原花青素，但由于植物来源不同，其中的原花青素含量不同，种类也不同，也表现出不同的功效。目前虽然对原花青素的相关研究较多，但都集中于单一来源的原花青素检测，对不同来源的原花青素没有进行有效的比较，特别是对于两种或多种不同来源的原花青素检测没有研究。对原花青素检测则主要集中于含量，因此如市场上有低价格的原花青素产品如葡萄籽原花青素掺假于银杏叶原花青素中，目前没有方法检测出。而由于不同成分功效不同，这种掺假行为对产品的危害极大。因此一种简单、反应灵敏、快速的对原花青素掺假的检测方法对保证人民用药安全意义重大。本发明人在长期研究中发现，银杏叶中的原花青素和其它植物来源的原花青素不同，如目前市场上低价的葡萄籽原花青素每个聚合度均只出一个峰，而银杏原花青素从二聚体开始，均有2 3个特征峰。如有效的加以利用，可成为鉴别银杏叶中是否掺假其它原花青素的关键点。为实现上述发明目的，本发明提供了以下一种解决方法，主要包括以下内容
I.银杏叶制剂样品前处理
由于银杏叶制剂中杂质成分会影响原花青素的测定，因此需要对银杏叶制剂进行前处理。前处理主要有三步1、将银杏叶制剂制成水溶液并上样于30-60目的聚酰胺树脂；11、去除20%丙酮溶液洗脱部位；111、收集80%丙酮溶液洗脱部位并干燥后用适量甲醇使其完全溶解。根据银杏叶制剂来源不同，固体制剂和液体制剂的上述前处理方法分述如下
(I)固体制剂将银杏叶制剂粉碎后，用20%丙酮溶液超声辅助溶解，过滤，去除不溶性
辅料；将滤液上样于30 60目的聚酰胺树脂，上样完成后用3 4倍体积的20%丙酮溶液洗脱，弃去该部位的洗脱液；再用3 4倍体积的80%丙酮溶液洗脱，得80%丙酮部位的洗脱液；将80%丙酮部位洗脱液回收至无丙酮味，用等体积乙酸丁酯萃取2次，弃去有机相，回收水相至干；残渣用适量甲醇使其完全溶解，即得甲醇溶解液。(2)液体制剂将银杏叶制剂直接上样于30 60目的聚酰胺树脂，上样完成后用3 4倍体积的20 %丙酮溶液洗脱，弃去该部位的洗脱液；再用3 4倍体积的80%丙酮溶液洗脱，80%丙酮部位的洗脱液；将80%丙酮部位洗脱液回收至无丙酮味，用等体积乙酸丁 酯萃取2次，弃去有机相，回收水相至干；残渣用适量甲醇使其完全溶解，即得甲醇溶解液。2.正相-高效液相色谱去(NP-HPLC)分离上述甲醇溶解液，并用HPLC进行检测，其中NP-HPLC色谱条件如下
(1)固定相为phenomenex 二兀醇柱(250X4. 6 mm, 5 μ m)；
(2)流动相为(A)乙腈，(B)甲醇/水/乙酸(95/3/2，V/V/V);流动相梯度为O 10min 0 12%B ；10 10. 01 min 12 15%B ； 10. 01 30 min 15 45%B ；30 35 min 45%B ;35 40 min 45 0%B ；
(3)流速为I. O ml/min ；
(4)检测波长突光激发波长276nm ;发射波长316 nm ；
(5)进样量为20UL03.色谱图对比
将上述方法所得的色谱图，与纯银杏叶提取物色谱图进行对比，如有掺假情况，则色谱图与纯银杏叶提取物色谱图会有明显不同。
通过上述方法可用于检测银杏叶制剂中原花青素是否有掺假，并且反应非常灵敏，极少量的原花青素掺假即可用本发明方法检测出，能检测出银杏叶提取物中掺O. 5%以上的其它来源原花青素，也就是O. 5%以上的原花青素掺假就可通过本发明方法加以检测鉴别。本发明不仅可用于银杏叶提取物制剂中原花青素是否有掺假，还可用于含银杏叶提取物的食品、保健品、医药品和/或化妆品，如银杏叶片、银杏叶注射液、银杏叶胶囊保健品等等；涉及的掺假原花青素的来源包括葡萄籽\松树片、苹果、山楂、花生、番荔枝、野草毒、越橘、酸果曼、莲房等等。通过本发明中的方法检测银杏叶制剂中的原花青素，受外界干扰少。本发明中对分析用样本的前处理方法，可以去除绝大多数杂质的干扰。采用本发明的方法对纯银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶胶囊、银杏叶注射剂进行检测，结果发现图谱形状一致，在所有图谱中均可见原花青素二聚体的两个明显特征峰、三聚体和四聚体特征峰。而其它检测方法则因存在大量的杂质，不能有效辨别其中的部分特征峰。说明本发明的方法特异性高，制剂中的其它成分不影响本发明方法的测定。
本发明人首先对纯银杏叶原花青素进行了检测，具体结果见实施例I。本发明中高效液相色谱法测定方法参见《中国药典》2010年版I部附录VI D高效液相色谱法，具体仪器条件等参见具体检测过程及实施例。本发明适用于各种剂型的银杏叶制剂中原花青素的分析和鉴别，前处理方法简单、操作步骤少；分析方法快速、准确；鉴别真伪方法容易、判断指标清晰明确。因此，本发明的方法对银杏叶各种剂型的制剂、含银杏叶提取物的食品、保健品、医药品和/或化妆品中原花青素的快速分析和鉴别，是合适的方法。借鉴并改良上述分析方法，使其适用并应用于银杏叶制剂中原花青素的分析，对于银杏叶制剂标准的提高及产业化的进一步发展意义重大。
图I为实施例I :银杏叶原花青素(A)和葡萄籽原花青素(B)的NP-HPLC色谱2为实施例2 :银杏叶片剂中原花青素的NP-HPLC色谱图(A)样I :未经任何前处理的样本；(B)样2 :经聚酰胺纯化，未经乙酸丁酯萃取的样本；(C)样3 :经本发明方法完全前处理的样本
图3为实施例3 :银杏叶胶囊剂中原花青素的NP-HPLC色谱4为实施例4 :银杏叶注射剂中原花青素的NP-HPLC色谱5为实施例5 :掺假银杏叶制剂中原花青素的NP-HPLC色谱图(A)掺入O. 5%葡萄籽原花青素；(B)掺入I. 0%葡萄籽原花青素；(C)掺入2. 0%葡萄籽原花青素；(D)掺入4. 0%葡萄籽原花青素；(E)未掺假。
具体实施例方式 本发明结合具体实施例进一步说明如下
实施例I银杏叶原花青素检测及与葡萄籽原花青素的对比
取自制的银杏原花青素提取物(原花青素含量为95%)和葡萄籽原花青素提取物(原花青素含量为96%)，分别溶于甲醇，过滤后，进行HPLC检测
设备Aglient 1200型高效液相色谱仪；Diamonsil C18色谱柱5 μ m 4. 6X 1 50mm色谱条件
(1)固定相为phenomenex 二兀醇柱(250X4. 6 mm, 5 μ m)；
(2)流动相为(A)乙腈，(B)甲醇/水/乙酸(95/3/2，V/V/V);流动相梯度为O 10min 0 12 %B ; 10 10. 01 min : 12 15 %B ; 10. 01 30 min : 15 45 %B ;30 35 min 45 %B ; 35 40 min :45 O %B ；
(3)流速为I. O ml/min ；
(4)检测波长突光激发波长276nm ;发射波长316 nm ；
(5)进样量为20UL0 结果见图1，从HPLC色谱图中可以发现，葡萄籽原花青素每个聚合度均只出一个峰，而银杏原花青素从二聚体开始，均有2 3个特征峰，其原因是构成银杏的原花青素组成与葡萄籽的原花青素组成不同。实施例2银杏叶片剂中原花青素的分析
样品来源银杏叶片(厂家浙江康恩贝制药股份有限公司，批号20100709)
样I :取片剂2片，研磨至细粉，用甲醇溶解，过滤，即得。样2 :取片剂2片，研磨至细粉，用16ml 20%丙酮溶液、超声辅助溶解，过滤，去除不溶性辅料；将滤液上样于30 60目的聚酰胺树脂，上样完成后用3 4倍体积的20%丙酮溶液洗脱，弃去该部位；再用3 4倍体积的80%丙酮溶液洗脱，得80%丙酮部位；将80%丙酮部位回收至干；残渣用甲醇溶解，即得甲醇溶解液。样3 :取片剂2片，研磨至细粉，用16ml 20%丙酮溶液、超声辅助溶解，过滤，去除不溶性辅料；将滤液上样于30 60目的聚酰胺树脂，上样完成后用3 4倍体积的20%丙酮溶液洗脱，弃去该部位；再用3 4倍体积的80%丙酮溶液洗脱，得80%丙酮部位；将80%丙酮部位回收至无丙酮味，用等体积乙酸丁酯萃取2次，弃去有机相，回收水相至干；残渣用甲醇溶解，即得甲醇溶解液。上述3个样本，分别用实施例I中的色谱条件进行原花青素的分离，结果见图2。从HPLC色谱图中可以发现，经过前处理的银杏叶片剂(样3)中，原花青素二聚体在14min左右和15min左右有两个明显的特征峰，同时三聚体和四聚体的特征峰也可分辨出来；未经任何前处理的样1，由于存在大量的杂质，因此几乎未出现原花青素的特征峰；经聚酰胺树脂纯化、未经有机溶剂萃取的样2，在去除了大量的杂质后，可以分辨出原花青素二聚体的两个特征峰，但由于仍存在较多的杂质，因此，三聚体较难辨别。实施例3银杏叶胶囊剂中原花青素的分析
样品来源天保宁胶囊(保健品，杭州康恩贝制药有限公司生产，批号20110516)
取胶囊剂2片，打开胶囊，倒出内容物，研磨至细粉，用16ml 20%丙酮溶液、超声辅助溶解，过滤，去除不溶性辅料。将滤液上样于30 60目的聚酰胺树脂，上样完成后用3 4倍体积的20%丙酮溶液洗脱，弃去该部位；再用3 4倍体积的80%丙酮溶液洗脱，得80%丙酮部位；将80%丙酮部位回收至无丙酮味，用等体积乙酸丁酯萃取2次，弃去有机相，回收水相至干；残渣用甲醇溶解，即得甲醇溶解液。用实施例I中的色谱条件进行原花青素的分离，结果见图3。从HPLC色谱图可清楚的分辨中原花青素二聚体的两个明显的特征峰，以及三聚体和四聚体的特征峰。
实施例4银杏叶注射剂中原花青素的分析
样品来源银杏叶注射剂(德国威玛舒培博士药厂生产，批号20110423)
取银杏叶注射剂一支，直接上样于30 60目的聚酰胺树脂，上样完成后用3 4倍体积的20%丙酮溶液洗脱，弃去该部位；再用3 4倍体积的80%丙酮溶液洗脱，得80%丙酮部位；将80%丙酮部位回收至无丙酮味，用等体积乙酸丁酯萃取2次，弃去有机相，回收水相至干；残渣用甲醇溶解，即得甲醇溶解液。用实施例I中的色谱条件进行原花青素的分离，结果见图4。由HPLC色谱图同样可清楚的分辨中原花青素二聚体的两个明显的特征峰，以及三聚体和四聚体的特征峰。实施例5掺假银杏叶制剂中原花青素的分析
在银杏叶提取物中模拟掺假葡萄籽提取物，并进行了相关检测。称取自制4份银杏提取物，分别为I. 99g、l. 98g、l. 96g、l. 92g ;依次加入葡萄籽提取物O. 01g、0. 02g、0. 04g、O. 08g，即掺假量分别为O. 5%、1. 0%、2. 0%、4. 0%。将上述四份掺假制剂分别用200ml 20%丙酮溶液、超声辅助溶解，过滤，去除不溶性辅料；将滤液上样于30 60目的聚酰胺树脂，上样完成后用3 4倍体积的20%丙酮溶液洗脱，弃去该部位；再用3 4倍体积的80%丙酮溶液洗脱，得80%丙酮部位；将80%丙酮部位回收至无丙酮味，用等体积乙酸丁酯萃取2次，弃去有机相，回收水相至干；残渣用甲醇溶解，即得甲醇溶解液。用实施例I中的色谱条件进行原花青素的分离，结果见图5。由HPLC色谱图可得，掺入葡萄籽原花青素的银杏提取物HPLC特征峰发生了明显的改变①二聚体两个峰的特征发生改变14min左右的峰为Procyanidin的二聚体峰，15min左右的峰为Prodelphinidin特有的二聚体峰，因此加入葡萄籽原花青素后，前峰较后峰的出峰强度更加明显、峰高更高、峰面积更大！②17min左右的Procyanidin三聚体峰，在未掺假制剂中，出峰不是很明显，但加入葡萄籽原花青素后，该峰出峰强度明显增加上述两种改变的趋势与葡萄籽原花青素加入量成正比。利用特征峰的变化和趋势，可以鉴别真伪，可以非常容易的鉴别出银杏叶制剂中是否有掺假。上述掺假原花青素的来源还可包括松树片、苹果、山楂、花生、番荔枝、野草莓、越橘、酸果蔓、莲房等。掺假后均可见最后所得色谱图的明显改变。
权利要求
1.一种鉴别银杏叶制剂中原花青素的方法，鉴别银杏叶制剂中是否掺假原花青素，包括以下步骤1)银杏叶制剂的前处理1、将银杏叶制剂制成水溶液并上样于30-60目的聚酰胺树脂；11、去除20%的丙酮溶液洗脱部位；111、收集80%的丙酮溶液洗胶部位并干燥后用适量甲醇使其完全溶解，获得甲醇溶解液；2)正相-高效液相色谱法分离上述甲醇溶解液，其中正相-高效液相色谱条件如下固定相为phenomenex 二元醇柱,250X4. 6 mm, 5μ m ;流动相为乙腈-甲醇/水/乙酸，其中乙腈为A，甲醇/水/乙酸为B，A+B=100%,甲醇/水/乙酸的体积比V/V/V为95/3/2 ;流动相梯度为O 10 min 0 12 %B ；10 10. 01min 12 15%B ； 10. 01 30 min : 15 45 %B ；30 35 min 45 %B ；35 40 min 45 O%B ;流速为I. O ml/min ;检测波长荧光激发波长276 nm ;发射波长316 nm ;进样量为20μ L ;3)色谱图对比将上述方法所得的色谱图，与纯银杏叶提取物色谱图进行对比，如有掺假情况，则色谱图与纯银杏叶提取物色谱图会有明显不同。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征是所述银杏叶制剂为固体制剂，将银杏叶固体制剂粉碎后，用20%丙酮溶液超声辅助溶解，过滤，去除不溶性辅料；将滤液上样于30 60目的聚酰胺树脂，上样完成后用3 4倍体积的20 %丙酮溶液洗脱，弃去该部位；再用3 4倍体积的80%丙酮溶液洗脱，得80%丙酮部位；将80%丙酮部位回收至无丙酮味，用等体积乙酸丁酯萃取2次，弃去有机相，回收水相至干；残渣用甲醇溶解，即得银杏叶制剂甲醇溶解液。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征是所述银杏叶制剂为液体制剂，将银杏叶制剂直接上样于30 60目的聚酰胺树脂，上样完成后用3 4倍体积的20%丙酮溶液洗脱，弃去该部位的洗脱液；再用3 4倍体积的80%丙酮溶液洗脱，80%丙酮部位的洗脱液；将80%丙酮部位洗脱液回收至无丙酮味，用等体积乙酸丁酯萃取2次，弃去有机相，回收水相至干；残渣用适量甲醇使其完全溶解，即得甲醇溶解液。
4.根据权利要求I或2或3所述的方法，其可用于含银杏叶提取物的食品、保健品、医药品和化妆品中掺假原花青素的检测。
5.根据权利要求I或2或3所述的方法，其特征是掺假原花青素的来源包括葡萄籽\松树片、苹果、山楂、花生、番蒸枝、野草莓、越橘、酸果蔓、莲房。
全文摘要
本发明提供一种鉴别银杏叶制剂、含银杏叶提取物的食品、保健品、医药品和/或化妆品等样本中是否含其他来源原花青素的分析鉴别方法，采用聚酰胺树脂纯化、有机溶剂萃取等方法前处理待检样品和标准品，以固定相为phenomenex二元醇柱，250×4.6mm，5μm；(A)乙腈-(B)甲醇/水/乙酸(95/3/2，V/V/V)为流动相；采用梯度洗脱，分别建立待检银杏叶制剂溶液样品和标准银杏叶制剂溶液标准品的正相-高效液相色谱图，对比分析色谱图。该鉴别方法，灵敏度高，分离度和重现性好，鉴别特征明显，能够准确鉴别银杏叶中掺0.5%以上的其它来源原花青素。
文档编号G01N30/14GK102818863SQ20121018404
公开日2012年12月12日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者叶剑锋, 乔洪翔, 方玲, 王如伟, 盛卫国, 闵会, 马丽萍, 姚建标 申请人:浙江康恩贝制药股份有限公司, 浙江现代中药与天然药物研究院有限公司