专利名称：银杏外种皮抗肿瘤有效部位及其制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种银杏外种皮抗肿瘤有效部位及其制剂的制备方法，属于中药制药 技术领域。
背景技术：
银杏又名白果，白果的最外层肉质皮即银杏外种皮，每年9，10月份白果成熟的季 节，产区臭烘烘的外种皮便随处可见，成了污染环境的主要来源。白果曾经是几十元1斤的 珍贵中药材及营养品，但近些年来由于种种原因，每斤仅2-5元的白果价格，严重地影响了 果农的积极性。我国拥有全世界3/4的银杏资源，为了很好地综合利用银杏资源，我们课题 组已经进行了十几年的研究，主要是从外种皮中提取具有抗肿瘤作用及用途的多糖类化合 物，已经取得了一系列研究成果。由于水溶性差是目前许多粗多糖制剂的共性问题，我们采 用以往的工艺制备的银杏外种皮多糖其水溶性也不是太理想，因而只能制成固体剂型，使 临床应用受到限制。抗肿瘤药物不但需要固体剂型，更需要液体剂型，如何提高所制备的银 杏外种皮多糖的水溶性，一直是本领域技术人员想要解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种银杏外种皮抗肿瘤有效部位及其 制剂的制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的，银杏外种皮抗肿瘤有效部位的制备方 法，其特征是包括以下步骤(1)将干银杏外种皮用90-98%的乙醇浸泡24_96h后滤去乙醇，将外种皮风干后 于90-99°C热水煎煮2-3次，每次煎煮l_2h，分别过滤后合并过滤液；(2)将过滤液减压浓缩至液料比为600-800% (V/W)后加入25% (W/V)组合盐溶 液，使浓缩过滤液的PH值为7. 0-7. 4，充分搅拌并静置4-6h后，再次过滤或离心3-5分钟去 除水不溶物；(3)将去除了水不溶物的浓缩过滤液用蒸馏水透析12_24h，将透析内液减压浓缩 至液料比为300-400% (V/W)后，向浓缩的透析内液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60-80% (V/V)，静置沉淀；(4)将沉淀物用90-98 %的乙醇洗涤2_4次后真空干燥或冷冻干燥，得到银杏外种 皮抗肿瘤有效部位。步骤(1)中所述的热水煎煮的料液比为1 10-1 20(V/ff)；步骤(2)中所述的组合盐溶液由氯化钠、碳酸钠及硫酸镁组成，三者重量之比为 8:1:1;步骤(3)中所述的透析采用截留值为7000-10000的透析膜，所用蒸馏水的体积是 浓缩过滤液体积的50-100倍；步骤(4)中所述的银杏外种皮抗肿瘤有效部位在1. 5% (W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水，其多糖含量与蛋白质含量之和大于60%。银杏外种皮抗肿瘤有效部位制剂的制备方法，其特征是将上述方法制备的银杏外 种皮抗肿瘤有效部位加入赋型剂或矫味剂和防腐剂制成抗肿瘤胶囊制剂或抗肿瘤口服液 制剂。本发明科学、合理、简单，将银杏外种皮在热水煎煮前先采用乙醇浸泡有利于脱 脂及脱色，有利于除去银杏外种皮中的银杏酸等医药限量物质，有利于热水煎煮使银杏外 种皮抗肿瘤有效部位的渗出，加入由氯化钠、碳酸钠及硫酸镁合理组合的含多种酸根的盐 溶液有利于除去水不溶物，将去除水不溶物的过滤液采用截留值为7000-10000的透析膜 经50-100倍体积的蒸馏水透析可除去各种小分子物质，将透析内液减压浓缩至液料比为 300-400% (V/W)后加入乙醇，进一步提高最终制得的银杏外种皮抗肿瘤有效部位的水溶 性和多糖与蛋白质含量。该方法制得的银杏外种皮有效部位多糖含量与蛋白质含量之和大 于60%，水溶性好，具有抗肿瘤活性，既可以制成固体剂型，也可以制成液体剂型，制备工艺 简便可行，适合工业化大生产。1、水溶性的测定银杏外种皮抗肿瘤有效部位在1. 5% (W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水。2、肽多糖含量(多糖含量+蛋白质含量)的测定采用苯酚硫酸法测多糖含量精密称取无水葡萄糖标准品适量，用蒸馏水配成 lmg/ml的葡萄糖标准液，再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为30ii g/ml、60ii g/ml、 90 u g/ml,120 u g/ml,150 u g/ml, 180 u g/ml 的葡萄糖标准溶液 0. 5ml 于 6 支 10ml 具塞 试管中，加入50mg/ml的重蒸酚溶液1ml，混合均勻后，加入5ml浓硫酸，混合均勻，沸水浴 15min,冷水浴30min。用紫外分光光度计于490nm处测定吸光度，对葡萄糖溶液浓度和吸光 度进行线性回归，建立回归方程。取银杏外种皮抗肿瘤有效部位供试品溶液0. 5ml，按上述 操作测吸光度值，代入回归方程，计算出多糖含量。采用考马斯亮蓝法测蛋白质含量精密称取牛血清白蛋白标准品适量，用蒸馏水 配成100 i! g/ml的蛋白标准溶液，再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为20 i! g/ml、 40 u g/ml、60 u g/ml、80 u g/ml、100 u g/ml 蛋白标准溶液0. 5ml 分别于 5 支 10ml 具塞试管， 再加入2. 5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇勻后，放置5 lOmin，待其充分反应后，用紫外分 光光度计于595nm处测定吸光度，对牛血清白蛋白溶液浓度和吸光度进行线性回归，建立 回归方程。取银杏外种皮抗肿瘤有效部位供试品溶液0. 5ml，按上述操作测吸光度值，代入 回归方程，计算出蛋白质含量。采用红外光谱分析仪进行定性分析。结果显示银杏外种皮抗肿瘤有效部位含酰胺 键，提示为肽多糖。肽多糖含量％=(多糖含量+蛋白质含量)％。 采用该方法制备的银杏外种皮抗肿瘤有效部位其多糖含量为36 %、蛋白质含量为 28%，所以肽多糖含量为36% +28%= 64%。3、药效研究取处于对数生长期的SMMC-7721细胞，用胰蛋白酶消化、Hank’ s液洗涤后，用含 10%小牛血清RPMI1640培养液调整细胞至IX 105/ml。向96孔培养板各孔中分别加入上 述细胞悬液lOOiil，在5% C02、37°C饱和湿度的培养箱中培养24h后，加入用含10%小牛 血清RPMI1640培养液配制的不同浓度的银杏外种皮抗肿瘤有效部位各100 iU，每个浓度设6个复孔，培养48h。培养结束前4h加入MTT (终浓度5mg/ml)，继续培养4h后弃去培养 液，加入酸化异丙醇，振荡lOmin，用酶标仪于570nm处测定各孔的0D值。按公式“抑制率 =(1-药物孔0D值/对照孔0D值)X 100%",计算体外对SMMC-7721细胞增殖的抑制率。 结果见表1。 表1银杏外种皮抗肿瘤有效部位对SMMC-7721人肝癌细胞的抑制作用 表1结果显示，银杏外种皮抗肿瘤有效部位在10-160 u g/ml剂量下对人肝癌细胞 具有直接抑制作用，而且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强。
具体实施例方式实施例1取干银杏外种皮200kg，加入95%的乙醇浸泡24h后滤去乙醇，将银杏外种皮风 干后于95°C热水煎煮，每次lh，共煎煮2次，料液比为1 10(V/W)。将煎煮液分别过滤合 并，将过滤液减压浓缩至液料比为600% (V/W)后加入浓度为25% (W/V)的由氯化钠、碳酸 钠及硫酸镁按重量比为8 1 1组合而成的盐溶液，使浓缩过滤液的pH值为7. 2，充分 搅拌后静置2h，再次过滤或按800转/分离心5分钟去除水不溶物；将去除了水不溶物的 浓缩过滤液采用截留值为7000的透析膜经50倍体积的蒸馏水透析12h，将透析内液再次 减压浓缩至液料比为300% (V/W)后，向浓缩的透析内液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60% (V/V)，静置沉淀；将沉淀物用90%乙醇洗涤2次后真空干燥或冷冻干燥，制得银杏外种皮 抗肿瘤有效部位干粉，该干粉在1. 5% (W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水。采用苯酚硫酸 法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为45%及23%，肽多糖总含量 为68%。采用MTT法体外检测对SMMC-7721细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入银杏外 种皮抗肿瘤有效部位，继续培养48h检测。结果显示，银杏外种皮抗肿瘤有效部位终浓度在 160 u g/ml, 80 u g/ml, 40 u g/ml, 20 u g/ml, 10 u g/ml 下可直接抑制 SMMC-7721 人肝癌细胞 生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率(％)分别为60，52，39，26及8。取银 杏外种皮抗肿瘤有效部位干粉100g，加入赋型剂100g，拌勻，按每粒200mg装入空心胶囊， 制成银杏外种皮抗肿瘤有效部位胶囊制剂。实施例2取干银杏外种皮400kg，加入90 %的乙醇浸泡72h后滤去乙醇，将银杏外种皮风干 后于90°C热水煎煮，每次1.5h，共煎煮3次，料液比为1 15(V/W)。将煎煮液分别过滤合并，将过滤液减压浓缩至液料比为700% (V/W)后加入浓度为25% (W/V)的由氯化钠、碳酸 钠及硫酸镁按重量比为8 1 1组合而成的盐溶液，使浓缩过滤液的pH值为7. 4，充分 搅拌后静置3h，再次过滤或按1000转/分离心4分钟去除水不溶物；将去除了水不溶物的 浓缩过滤液采用截留值为8000的透析膜经80倍体积的蒸馏水透析18h，将透析内液再次 减压浓缩至液料比为350% (V/W)后，向浓缩的透析内液中加入乙醇，使乙醇终浓度为70% (V/V)，静置沉淀；将沉淀物用98%乙醇洗涤3次后真空干燥或冷冻干燥，制得银杏外种皮 抗肿瘤有效部位干粉，该干粉在1. 5% (W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水。采用苯酚硫酸 法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为44%及22%，肽多糖总含量 为66%。采用MTT法体外检测对SMMC-7721细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入银杏外 种皮抗肿瘤有效部位，继续培养48h检测。结果显示，银杏外种皮抗肿瘤有效部位终浓度在 160 u g/ml，80 u g/ml，40 u g/ml，20 u g/ml, 10 u g/ml 下可直接抑制 SMMC-7721 人肝癌细胞 生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率(% )分别为58，49，37，21及10。取 银杏外种皮抗肿瘤有效部位干粉200g溶解于纯化水中，按药物质量要求加入适量矫味剂 及防腐剂，摇勻，按10ml规格装瓶，制成银杏外种皮抗肿瘤有效部位口服液制剂。实施例3取干银杏外种皮200kg，加入98 %的乙醇浸泡96h后滤去乙醇，将银杏外种皮风干 后于99°C热水煎煮，每次2h，共煎煮2次，料液比为1 20 (V/W)。将煎煮液分别过滤合并， 将过滤液减压浓缩至液料比为800% (V/W)后加入浓度为25% (W/V)的由氯化钠、碳酸钠 及硫酸镁按重量比为8 1 1组合而成的盐溶液，使浓缩过滤液的pH值为7.0，充分搅 拌后静置4h，再次过滤或按1200转/分离心3分钟去除水不溶物；将去除了水不溶物的浓 缩过滤液采用截留值为10000的透析膜经100倍体积的蒸馏水透析24h，将透析内液再次 减压浓缩至液料比为400% (V/W)后，向浓缩的透析内液中加入乙醇，使乙醇终浓度为80% (V/V)，静置沉淀；将沉淀物用95 %乙醇洗涤4次后真空干燥或冷冻干燥，制得银杏外种皮 抗肿瘤有效部位干粉，该干粉在1. 5% (W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水。采用苯酚硫酸 法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为41%及21%，肽多糖总含量 为62%。采用MTT法体外检测对SMMC-7721细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入银杏外 种皮抗肿瘤有效部位，继续培养48h检测。结果显示，银杏外种皮抗肿瘤有效部位终浓度在 160 u g/ml, 80 u g/ml, 40 u g/ml, 20 u g/ml, 10 u g/ml 下可直接抑制 SMMC-7721 人肝癌细胞 生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率(％)分别为64，54，40，23及12。取银 杏外种皮抗肿瘤有效部位干粉100g，加入赋型剂100g，拌勻，按每粒200mg装入空心胶囊， 制成银杏外种皮抗肿瘤有效部位胶囊制剂。
权利要求
一种银杏外种皮抗肿瘤有效部位的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)将干银杏外种皮用90 98％的乙醇浸泡24 96h后滤去乙醇，将银杏外种皮风干后于90 99℃热水煎煮2 3次，每次煎煮1 2h，分别过滤后合并过滤液；(2)将过滤液减压浓缩至液料比为600 800％(V/W)后加入25％(W/V)组合盐溶液，使浓缩过滤液的pH值为7.0 7.4，充分搅拌后静置2 4h，再次过滤或离心3 5分钟去除水不溶物；(3)将去除了水不溶物的浓缩过滤液用蒸馏水透析12 24h，将透析内液减压浓缩至液料比为300 400％(V/W)后，向浓缩的透析内液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60 80％(V/V)，静置沉淀；(4)将沉淀物用90 98％的乙醇洗涤2 4次后真空干燥或冷冻干燥，得到银杏外种皮抗肿瘤有效部位。
2.根据权利要求1所述的银杏外种皮抗肿瘤有效部位的制备方法，其特征是步骤(1) 中所述的热水煎煮的料液比为1 10-1 20(V/W)。
3.根据权利要求1所述的银杏外种皮抗肿瘤有效部位的制备方法，其特征是步骤(2) 中所述的组合盐溶液由氯化钠、碳酸钠及硫酸镁组成，三者重量之比为8 1 1，离心速度 为 800-1200 转 / 分。
4.根据权利要求1所述的银杏外种皮抗肿瘤有效部位的制备方法，其特征是步骤(3) 中所述的浓缩过滤液用蒸馏水透析的透析膜截留值为7000-10000，蒸馏水的体积是浓缩过 滤液体积的50-100倍。
5.根据权利要求1所述的银杏外种皮抗肿瘤有效部位的制备方法，其特征是步骤(4) 中所述的银杏外种皮抗肿瘤有效部位在1.5% (W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水，其多 糖含量与蛋白质含量之和大于60%。
6.一种银杏外种皮抗肿瘤有效部位制剂的制备方法，其特征是将上述方法制备的银杏 外种皮抗肿瘤有效部位加入赋型剂或矫味剂和防腐剂制成抗肿瘤胶囊制剂或抗肿瘤口服 液制剂。全文摘要
本发明涉及一种银杏外种皮抗肿瘤有效部位及其制剂的制备方法，属于中药制药技术领域。将干银杏外种皮用乙醇浸泡后滤去乙醇，风干后用热水煎煮2-3次，分别过滤后合并过滤液，向减压浓缩后的过滤液中加入组合盐溶液，过滤或离心去除水不溶物后用蒸馏水透析；将透析内液减压浓缩后加入乙醇，静置沉淀；将沉淀物用乙醇洗涤并干燥，制得含有蛋白及多糖成分的银杏外种皮抗肿瘤有效部位；将银杏外种皮抗肿瘤有效部位加入赋型剂或矫味剂和防腐剂制成抗肿瘤胶囊制剂或抗肿瘤口服液制剂。该银杏外种皮有效部位的多糖及蛋白质含量之和大于60％，水溶性好，抗肿瘤效果好，既可以制成固体剂型，也可以制成液体剂型，制备工艺简便可行，适合工业化大生产。
文档编号A61K36/16GK101912426SQ201010251068
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者傅恩赐, 王龙祥, 许爱华, 郑媛媛, 陈华圣 申请人:扬州大学