一种评价Bt毒蛋白对鳞翅目幼虫毒力的测定方法
【专利摘要】一种评价Bt毒蛋白对鳞翅目幼虫毒力的测定方法，包括以下步骤：(1)人工饲料预处理；(2)饲料表面的Bt毒蛋白涂染和毒力的测定；(3)试验统计。本发明Bt蛋白毒力测定方法采用挤瓶饲料倒入到24孔培养板中，速度快、效率高，能够形成均一的表面积，加入Bt蛋白后，能形成均匀稳定的表面浓度，不仅可以准确的测定Bt蛋白毒力，还能节约蛋白，达到测试成本较低的效果。
【专利说明】
一种评价Bt毒蛋白对鱗翅目幼虫毒力的测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种评价Bt毒蛋白毒力的测定方法，具体涉及一种评价Bt毒蛋白对鳞 翅目幼虫毒力的测定方法。
【背景技术】
[0002] 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一类包括许多亚种并对多 种昆虫具有高毒力的产晶体芽孢杆菌，属于革兰式阳性细菌，是世界上应用最为广泛的微 生物杀虫剂。当敏感昆虫摄食Bt晶体蛋白后，伴胞晶体进入中肠，在碱性条件下经过溶解和 激活作用，释放出毒素核心片断，然后作用于中肠上皮细胞，引起该细胞膨胀和裂解，最后 导致昆虫肠道麻痹、穿孔或停止进食，直至虫体死亡。因此，在评价Bt杀虫剂或Bt毒蛋白的 毒力、靶标害虫和次要靶标害虫对Bt毒蛋白的敏感性差异、对靶标害虫的抗性监测等方面， 需要一个合适的毒力测定方法。
[0003] 目前，通常将Bt杀虫剂或Bt毒蛋白与饲料进行混合，称饲料混合法，是常用的对Bt 毒力测定的方法。该方法是将Bt蛋白稀释成系列浓度，混入到50 °C左右的人工饲料中进行 搅拌，或者将Bt蛋白稀释成系列浓度混入到4°C保存的饲料中。这两种方法本质均是将Bt毒 蛋白均匀混合在人工饲料中，来饲喂初孵幼虫进行取食。但这两种方法也都存在着局限性， 首先，前者需要混合到50°C左右的人工饲料中，容易使Bt毒蛋白降解;其次，这两种方法将 极其少量的Bt蛋白均匀混合到人工饲料中，存在着混合不均匀等问题;另外，应用饲料混合 法，待害虫取食几天后弃掉，也容易造成蛋白的浪费等问题。
[0004] 鳞翅目幼虫，例如棉铃虫、玉米螟、小地老虎、粘虫、甜菜夜蛾等在人工饲养过程 中，发现初孵的幼虫都具有在饲料表面取食的习性，从而将饲料表面涂染Bt毒蛋白进行生 物测定成为一种可能，由此，探索一种评价Bt毒蛋白对鳞翅目幼虫毒力的测定方法，来客观 正确的评价Bt毒蛋白的毒力效果，也将为指导鳞翅目幼虫的防治提供技术支持。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种评价Bt毒蛋白对鳞翅目幼虫毒力的测定 方法，该方法可防止蛋白遇高温降解，浓度混合均匀以及蛋白的浪费问题，经济成本低，操 作简单，可准确测定Bt毒蛋白毒力。
[0006] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种评价Bt毒蛋白对鳞翅目幼虫毒力 的测定方法，包括以下步骤：
[0007] (1)人工饲料预处理:将人工饲料在40~50 °C未凝固时，倒入塑料挤瓶，然后挤入 到24孔板里面，其中每个小孔挤入1.5~2ml，孔的直径为1.6cm，凝固后，饲料形成表面积为 2cm 2，备用；
[0008] (2)饲料表面的Bt毒蛋白涂染和毒力的测定：将待测的Bt毒蛋白用缓冲液进行系 列稀释成6~10个浓度，用移液枪吸取每个浓度的蛋白液体40~45μ1到小孔里，摇匀，正好 全部覆盖饲料表面，待液体蒸发后，接入鳞翅目初孵幼虫，每孔1头，盖上盖子，扎紧，放在温 度为25~27°C、相对湿度为75~85%、光照L/D = 16h/8h的条件下，以添加40~45μ1的缓冲 液的为对照，重复3~4次，7d后观察试验组和对照组试虫死亡情况，并称取存活幼虫体重；
[0009] (3)试验统计:拟合Bt毒蛋白对幼虫的毒力曲线和生长发育抑制曲线，计算出LC50 值(半数致死量)和体重抑制半数量GIC 5Q值(体重抑制半数量)及95%置信限，采用LC5Q值的 95%置信限或GIC5Q值的95%置信限为衡量参数检验Bt毒蛋白对不同种类害虫的毒力是否 显著，如不重叠，则表明毒力间有差异。
[0010] 进一步，步骤(2)中，所述系列浓度为6~10个等比浓度梯度。
[0011] 进一步，步骤(2)中，所述鳞翅目初孵幼虫为孵化后12h内的初孵幼虫。
[0012] 进一步，步骤(2)中，所述试验组饲料中的Bt毒蛋白含量控制在杀死率10~90 %范 围内。
[0013] 进一步，所述Bt蛋白含量的控制方法为将Bt蛋白配置一定浓度的溶液，按照步骤 (2)加入人工饲料表面摇匀，然后选取12h内初孵幼虫作为试虫，在人工饲料中接入试虫7天 后，根据死亡情况，上调或下调Bt蛋白浓度，使杀死试虫的比例占10~90%。
[0014] 本发明Bt蛋白毒力测定方法采用挤瓶饲料倒入到24孔培养板中，速度快、效率高， 能够形成均一的表面积，加入Bt蛋白后，能形成均匀稳定的表面浓度，不仅可以准确的测定 Bt蛋白毒力，还能节约蛋白，达到测试成本较低的效果。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明进一步加以说明。以下各实施例中所用原料，如无特别 说明，则均为市售。
[0016] 实施例1:评价CrylF毒蛋白对小地老虎幼虫毒力的测定方法
[0017] (1)小地老虎幼虫人工饲料的制备:根据CN 200810112399.7中描述的方法制备小 地老虎幼虫人工饲料，将制备好的人工饲料冷却到50°C时(未凝固前），倒入塑料挤瓶，然后 倒入到24孔板里面，其中，每个小孔挤入1.5~2ml，孔的直径为1.6cm，凝固后，饲料形成表 面积为2cm2,备用；
[0018] (2)试验对象的准备:小地老虎孵化后12h内的初孵幼虫；
[0019] (3)饲料表面的Bt毒蛋白涂染和毒力的测定:将待测的CrylF蛋白用CAPS缓冲(pH = 10.5)进行系列稀释成 10 个浓度（0，1·3,2·6,5·2，10·4,20·8,41·6,83·3，166·6,333·3μ g/ml)，用移液枪吸取每个浓度的蛋白液体40μ1到小孔里，摇匀，使蛋白全部覆盖饲料表面 最终使饲料表面积浓度为（0，26，52，104，208，416，833，1666，3333，6666ng/cm 2);待液体蒸 发后，接入初孵幼虫，每孔1头，盖上盖子，扎紧，放在温度为25~27°C、相对湿度为75~ 85%、光照L/D= 16h/8h的条件下，以添加40μ1的缓冲液的为对照，重复3~4次，7d后观察试 验组和对照组试虫死亡情况;并称取存活幼虫体重；
[0020] (4)试验统计:采用polo_pc(Leora，1987)软件进行分析，拟合蛋白对幼虫的毒力 曲线和生长发育抑制曲线，查找或计算出LC5Q值和GIC5Q值及95 %置信限，采用LC5Q值或GIC50 值的95 %置信限为衡量参数，并与其他害虫种群的LC5Q值或GIC5Q值的95 %置信限是否重叠 来判断不同毒力间是否有差异；
[0021] (5)统计结果：统计结果见表1。由表1可知，小地老虎对CrylF LC5Q值为 1069 · 967ng/cm2(95%CI 700 · 328-1678 · 959)，GIC5〇值为359 · 726ng/cm2(95%CI 189 · 403- 643.918)。
[0022]实施例2:评价CrylF毒蛋白对玉米螟初孵幼虫的毒力测定方法 [0023] (1)玉米螟人工饲料的制备:根据CN 97100519.2中描述的方法制备玉米螟人工饲 料，将制备的人工饲料冷却到50°C时（未凝固前），倒入塑料挤瓶，然后挤入到24孔板里面， 其中，每个小孔里面，挤入1.5~2ml，孔的直径为1.6cm，凝固后，饲料形成表面积为2cm2,备 用。
[0024] (2)试验对象准备:玉米螟孵化后12h内的初孵幼虫。
[0025] (3)饲料表面的Bt毒蛋白涂染和毒力的测定:将待测的CrylF蛋白用CAPs缓冲，pH =10.5，进行系列稀释成7个浓度(0,0.03125,0.0625,0.125,0.25,0.5，1，2以8/1111)，用移液 枪吸取每个浓度的蛋白液体40μ1到小孔里，摇匀，使蛋白全部覆盖饲料表面，最终使饲料表 面积浓度为〇，〇. 625，1.25，2.5，5，10，20ng/cm2，待液体蒸发后，接入初孵幼虫，每孔1头，盖 上盖子，扎紧，放在温度为25~27°C、相对湿度为75~85 %、光照L/D= 16h/8h的条件下，以 添加40μ1的缓冲液的为对照，重复3~4次，7d后观察试验组和对照组试虫死亡情况;并称取 存活幼虫体重。
[0026] (4)试验统计:采用polo_pc(Leora，1987)软件进行分析，拟合蛋白对幼虫的毒力 曲线和生长发育抑制曲线，查找或计算出LC5Q值和GIC5Q及95 %置信限，采用LC5Q值或GIC50值 的95%置信限为衡量参数，并与其他害虫种群的LC5Q值或GIC5Q值的95%置信限是否重叠来 判断不同毒力间是否有差异。
[0027] (5)统计结果：统计结果见表1。由表1可知，玉米螟对CrylF的LC5Q值为5.774ng/cm 2 (95%CI 3.536-10.281)，GIC5〇值为3.990ng/cm2(95%CI 2.256-7.023)
[0028]实施例3:评价CrylF毒蛋白对粘虫初孵幼虫的毒力测定方法
[0029] (1)粘虫的人工饲料的制备:根据CN201010197333.X中描述的方法制备粘虫的人 工饲料，将制备的人工饲料冷却到50°C时(未凝固前），倒入塑料挤瓶，然后挤入到24孔板里 面，每个小孔里面，挤入1.5~2ml，孔的直径为1.6cm，凝固后，饲料形成表面积为2cm2,备 用。
[0030] (2)试验对象准备:粘虫孵化后12h内的初孵幼虫。
[0031] (3)饲料表面的Bt毒蛋白涂染和毒力的测定:将待测的CrylF蛋白用CAPs缓冲，pH =10.5，进行系列稀释成9个浓度(0，1.3,2.6,5.2，10.4,20.8,41.6,83.3，166.648/1111)，用 移液枪吸取每个浓度的蛋白液体40μ1到小孔里，摇匀，使蛋白全部覆盖饲料表面，最终使饲 料表面积浓度为0，26，52，104，208，416，833，1666，3333ng/cm 2，待液体蒸发后，接入初孵幼 虫，每孔1头，盖上盖子，扎紧，放在温度为25~27 °C、相对湿度为75~85 %、光照L/D = 16h/ 8h的条件下，以添加40μ1的缓冲液的为对照，重复3~4次，7d后观察试验组和对照组试虫死 亡情况;并称取存活幼虫体重。
[0032] (4)试验统计:采用polo_pc(Leora，1987)软件进行分析，拟合蛋白对幼虫的毒力 曲线和生长发育抑制曲线，查找或计算出LC5Q值和GIC5Q值及95 %置信限，采用LC5Q值或GIC50 值的95 %置信限为衡量参数，并与其他害虫种群的LC5Q值或GIC5Q值的95 %置信限是否重叠 来判断不同毒力间是否有差异。
[0033] (5)统计结果：统计结果见表1。由表1可知，粘虫种群对CrylF的LC5Q值为 845 · 506ng/cm2(95 %CI 463 · 702-1669 · 244)，GIC5〇值为488 · 699ng/cm2(95%CI225 · 808- 1092.783)。
[0034]综上，根据95 %置信区间是否重叠，可知玉米螟对Cry IF最为敏感，其次是粘虫，最 后是小地老虎，其中小地老虎与玉米螟的敏感度相差184倍。
[0035] 表1-玉米害虫对CrylF的敏感度比较
[0036]
【主权项】
1. 一种评价Bt毒蛋白对鳞翅目幼虫毒力的测定方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 人工饲料预处理:将人工饲料在40~50 °C未凝固时，倒入塑料挤瓶，然后挤入到24 孔板里面，其中每个小孔挤入1.5~2ml，孔的直径为1.6cm，凝固后，饲料形成表面积为 2cm 2，备用； (2) 饲料表面的Bt毒蛋白涂染和毒力的测定:将待测的Bt毒蛋白用缓冲液进行系列稀 释成6~10个浓度，用移液枪吸取每个浓度的蛋白液体40~45μ1到小孔里，摇勾，正好全部 覆盖饲料表面，待涂染Bt毒蛋白液体蒸发后，接入鳞翅目初孵幼虫，每孔1头，盖上盖子，扎 紧，放在温度为25~27°C、相对湿度为75~85%、光照L/D= 16h/8h的条件下，以添加40~45 μL的缓冲液的为对照，重复3~4次，7d后观察试验组和对照组试虫死亡情况，并称取存活幼 虫体重； (3) 试验统计:拟合Bt毒蛋白对幼虫的毒力曲线和生长发育抑制曲线，计算出LC5Q值和 6IC5Q值及95%置信限，采用^： 5()值的95%置信限或61(：5()值的95%置信限为衡量参数检验财 毒蛋白对不同种类害虫的毒力是否显著，如不重叠，则表明毒力间有差异。2. 根据权利要求1所述的评价Bt毒蛋白对鳞翅目幼虫毒力的测定方法，其特征在于，步 骤(2)中，所述系列浓度为6~10个等比浓度梯度。3. 根据权利要求1所述的评价Bt毒蛋白对鳞翅目幼虫毒力的测定方法，其特征在于，步 骤(2)中，所述鳞翅目初孵幼虫为孵化后12h内的初孵幼虫。4. 根据权利要求1所述的评价Bt毒蛋白对鳞翅目幼虫毒力的测定方法，其特征在于，步 骤(2)中，所述试验组饲料中的Bt毒蛋白含量控制在杀死率10~90 %范围内。5. 根据权利要求3所述的评价Bt毒蛋白对鳞翅目幼虫毒力的测定方法，其特征在于，所 述Bt蛋白含量的控制方法为将Bt蛋白配置一定浓度的溶液，按照步骤(2)加入人工饲料表 面摇匀，然后选取12h内初孵幼虫作为试虫，在人工饲料中接入试虫7天后，根据死亡情况， 上调或下调Bt蛋白浓度，使杀死试虫的比例占10~90%。
【文档编号】G01N33/68GK105866425SQ201610216309
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】李国平, 封洪强, 黄建荣, 钟景, 封洪云, 黄博, 田彩红, 邱峰
【申请人】河南省农业科学院植物保护研究所