一种乳腺癌三联检诊断试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物检测领域，具体涉及一种肿瘤血清标志物CA125、HE4和P?her2的乳腺癌三联检诊断试剂盒。本发明提供的乳腺癌三联检诊断试剂盒主要由抗体酶标板、生物素抗体包被板、牛血清白蛋白、血清稀释液、辣根过氧化物酶、四甲基联苯胺、硫酸、阴性对照液和阳性对照液组成。本发明提供的乳腺癌三联检诊断试剂盒可以检测手术治疗后患者或复发及转移性肿瘤患者体内CA125、HE4和p?her2的表达水平，对乳腺癌的临床诊断具有重要意义；而且本发明提供的乳腺癌三联检诊断试剂盒可以降低血清中其他物质的干扰，大大的提高检测结果的准确性和稳定性，有利于乳腺癌患者的早期诊断和预后处理。
【专利说明】
一种乳腺癌三联检诊断试剂盒
技术领域
[00011本发明属于生物检测领域，具体涉及一种肿瘤血清标志物CA125、HE4和P-her2的 乳腺癌三联诊断试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是一种较为常见的恶性肿瘤疾病，是发病率最高的女性恶性肿瘤疾病，约 占各种恶性肿瘤疾病的10 %-12%。经相关研究显示，全世界每年大约有160万人被诊断了 为乳腺癌，并且每年约有50万人死于该疾病。而且乳腺癌的发病率正以每年4%的速度递 增，患者人群也开始年轻化，严重威胁全球女性的身心健康。因此，加强对乳腺癌治疗技术 的研究是极其必要的。
[0003] CA125、HE4和p-her2在乳腺癌中具有较高的表达。近年来，肿瘤患者血清CA125、 HE4和p-her2水平在肿瘤临床实践中的应用价值已引起越来越多的关注。国外已有血清检 测试剂盒被批准用于临床，并且CA125、HE4和p-her2血清水平及其变化趋势可用作肿瘤治 疗效果的评价与预后评估指标。因此CA125、HE4和p-her2血清水平检测在肿瘤诊断和治疗 中有着重要的应用价值。
[0004] 传统的CA125、HE4和p-her2检测主要是通过创伤性的肿瘤组织活检，使用免疫组 化（IHC)和荧光原位杂交(FISH)等方法，但是这些方法不能检测手术治疗后患者或复发及 转移性肿瘤患者体内的CA125、HE4和p-her2表达水平。因此，研究和开发出可以用于检测手 术治疗后患者或复发及转移性肿瘤患者体内的CA125、HE4和p-her2表达水平，无创伤性的 乳腺癌肿瘤检测方法仍是当前亟需解决的难题。
[0005] 中国专利申请201510038319.8公开了 一种肿瘤相关抗体定量检测试剂盒，所述试 剂盒是将一种肿瘤抗原性的植物蛋白作为抗原包被在96孔板中，以不同受试者血清中的肿 瘤抗体作为一抗，标记辣根过氧化酶的羊抗人抗体作为二抗，采用间接免疫发光学技术来 检测受试者血清中肿瘤抗体。
[0006] 中国专利申请201510600309.9公开了一种用于检测血清HER2的试剂盒及用途，所 述试剂盒包括配对的抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗和生物素化的A18,该试剂盒是通过酶 联免疫吸附法(ELISA)来检测乳腺癌患者血清中的HER2表达水平，从而达到检测乳腺癌的 目的。该试剂盒是一种无创伤性、简便、迅速的诊断和监测HER2阳性肿瘤病程发展的用于检 测乳腺癌的检测试剂盒。
[0007] 然而，现有的血清检测试剂盒只能检测单一的指标，在检测过程中存在灵敏性和 特异性较低的缺陷，大大的限制了上述产品的推广和应用。
【发明内容】
[0008] 为了解决现有技术中的乳腺癌诊断试剂盒的不足，本发明目的在于提供一种乳腺 癌三联检诊断试剂盒，相比于现有的乳腺癌诊断试剂盒，本发明乳腺癌诊断试剂盒具有更 高的灵敏度高和更强的特异性。
[0009] 本发明提供了一种乳腺癌三联检诊断试剂盒，包括抗体酶标板、生物素抗体包被 板、牛血清白蛋白、血清稀释液、辣根过氧化物酶、四甲基联苯胺、硫酸、阴性对照液和阳性 对照液;所述酶标板抗体包括包被在酶标板上的抗CA125、HE4和p-her2单克隆抗体;所述生 物素抗体包被板包括包被在微孔板的生物素标记的CA125、HE4和p-her2单克隆抗体。
[0010] 进一步地，所述抗体酶标板的制备方法为：用pH为8.2的ros缓冲液将抗CA125、HE4 和p-her2单克隆抗体稀释至20-100μg/ml，按100μΙ/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度 为2-8 °C的条件下放置过夜，然后用洗涤液洗涤，所述洗涤液为含有0.05 % Tween-20，pH为 7.4的磷酸盐缓冲液，甩干，得包被有抗CA125、HE4和p-her2单克隆抗体的96孔酶标板。 [0011]进一步地，所述生物素抗体包被板的制备方法为:将CA125、HE4和p-her2单克隆抗 体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得生物素CA125、HE4、p-her2 单克隆抗体;用pH为8.2的?83缓冲液将04125、册4、？-1^^2单克隆抗体稀释至20-10(^8/1111， 按100μΙ/孔的加入量加于微孔板中，在温度为2-8°C的条件下放置过夜，然后用洗涤液洗 涤，所述洗涤液为含有〇 . 05 % Tween 20，pH为7.4的磷酸盐缓冲液，甩干，得包被有生物素 CA125、HE4和p-her2单克隆抗体的微孔板。
[0012] 进一步地，所述血清稀释液由以下组分组成：
[0013] 人胰岛素5-8U/ML、磷酸二氢钾2-4g/L、磷酸氢二钠2-4g/L、硫酸钠4-6g/L、氯化钠 20-248/1、脱氧胆酸钠10-14 8/140了4-21(0.4-0.68/1，余量为水。
[0014] 进一步地，所述血清稀释液由以下组分组成：
[0015] 人胰岛素6U/ML、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠3g/L、硫酸钠5g/L、氯化钠22g/L、脱 氧胆酸钠12g/L、EDTA-2K 0 · 5g/L，余量为水。
[0016] 进一步地，所述血清稀释液的pH值为6.2-6.5。
[00?7]进一步地，所述血清稀释液的pH值为6.4。
[00?8]进一步地，所述四甲基联苯胺的浓度为0.4mg/ml。
[0019]进一步地，所述硫酸的浓度为2mol/L。
[0020] 本发明是在常规酶联免疫吸附试验的基础上，通过生物素与辣根过氧化物酶之间 的作用，建立了一种高灵敏度的生物素-酶联免疫检测试剂盒，以测定待测样中的肿瘤蛋白 CA125、HE4和p-her2的表达水平。因为生物素很易与抗体等蛋白质以共价键结合，所以有生 物素标记的CA125、HE4、p-her2单克隆抗体中的生物素容易与辣根过氧化物酶产生反应，既 起到多级放大的作用，同时由于酶在遇到相应的显色底物时会发生催化作用而呈色的作 用，从而达到检测目标抗原或抗体分子的目的。采用本发明的乳腺癌三联检诊断试剂盒可 以有效、稳定地测定乳腺癌患者血清中CA125、HE4和p-her2的含量，其灵敏度高，测试重复 性好。
[0021] 进一步地，本发明提供的血清稀释液可以有效的减少受检血清中其他物质的干 扰，可以大大的提高CA125、HE4和p-her2检测的灵敏度和稳定性，有利于乳腺癌患者的早期 诊断和预后处理。
[0022] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：
[0023] (1)本发明提供的乳腺癌三联检诊断试剂盒可以检测手术治疗后患者或复发及转 移性肿瘤患者体内的CA125、HE4和p-her2表达水平，对乳腺癌的临床诊断具有重要意义；
[0024] (2)本发明提供的乳腺癌三联检诊断试剂盒可以降低血清的其他物质的干扰，大 大的提高检测结果准确性和稳定性，有利于乳腺癌患者的早期诊断和预后处理。
【具体实施方式】
[0025]下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求 保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附 权利要求书记载的内容为准。下列实施例中未注明具体试验条件的试验方法，通常按照常 规条件，分子克隆试验指南（Sambrook J，et al.2008.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd Ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0026]实施例1、乳腺癌三联检诊断试剂盒 [0027] 1、乳腺癌三联检诊断试剂盒的制备
[0028] 1.1、抗体酶标板的制备方法为：
[0029] 用pH为8.2的roS缓冲液将抗CA125、HE4和p-her2单克隆抗体稀释至60μg/ml，按 100μΙ/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为4°C的条件下放置过夜，然后用洗涤液洗 涤，所述洗涤液为含有〇. 05 % Tween 20，pH为7.4的磷酸盐缓冲液，甩干，得包被有抗CA125、 HE4和p-her2单克隆抗体的96孔酶标板。
[0030] 1.2、生物素抗体包被板的制备方法为：
[0031]将CA125、HE4和p-her2单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结 合的生物素，得生物素 CA125、HE4和p-her2单克隆抗体；用pH为8.2的roS缓冲液将CA125、 HE4和p-her2单克隆抗体稀释至50μg/ml，按100μ1/孔的加入量加于微孔板中，在温度为4°C 的条件下放置过夜，然后用洗涤液洗涤，所述洗涤液为含有〇. 05 % Tween 20，pH为7.4的磷 酸盐缓冲液，甩干，得包被有生物素 CA125、HE4和p-her2单克隆抗体的微孔板。
[0032] 1.3、血清稀释液的配置：
[0033] 取人胰岛素5-8U/ML、磷酸二氢钾2-4g/L、磷酸氢二钠2-4g/L、硫酸钠4-6g/L、氯化 钠20-248/1、脱氧胆酸钠10-148/140了六-21(0.4-0.68/1，加水调节?!1为6.2-6.5。
[0034] 2、乳腺癌三联检诊断试剂盒的使用步骤：
[0035] 2.1、加样：
[0036] (1)包被有抗CA125、HE4和p-her2单克隆抗体的96孔酶标板处理：
[0037]在包被有抗CA125、HE4和p-her2单克隆抗体的96孔酶标板上划分阳性对照孔、阴 性对照孔、待测样品孔和空白孔共四组检测孔，阳性对照孔中加入阳性对照液，1〇〇μ1/孔， 阴性对照孔中加入阴性对照液，1〇〇μ1/孔，待测样品孔中加入待测血清，1〇〇μ1/孔，样本加 完后，然后每孔加入50ul量的浓度为0.5 %的牛血清白蛋白和50ul量的血清稀释液，所述的 血清稀释液为：人胰岛素 6U/ML、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠 3g/L、硫酸钠 5g/L、氯化钠 22g/L、脱氧胆酸钠 12g/L、EDTA-2K 0 · 5g/L，加水调节pH值为6 · 4;在酶标板上加盖或者覆 膜，在37 °C条件下放置2h后弃去液体，用洗涤液洗涤，甩干；
[0038] (2)加入生物素CA125、HE4和p-her2单克隆抗体：
[0039] 每个检测孔中加入100μ1生物素CA125、HE4和p-her2单克隆抗体，在37°C条件下放 置lh后弃去液体，每个检测孔中加入350μ1洗涤液浸泡2min，甩干或轻轻地拍干，洗涤、甩干 的动作重复3次；
[0040] (3)加入辣根过氧化物酶：
[0041 ]每个检测孔中加入100μΙ的辣根过氧化物酶，在37°C条件下放置lh后弃去液体，每 个检测孔中加入350μ1洗涤液浸泡2min，甩干或轻轻地拍干，洗涤、甩干的动作重复5次； [0042] (4)加入显色底物：
[0043]在每个检测孔中依次加入一滴浓度为0.4mg/ml四甲基联苯胺，在37°C条件下避 光赘显色；
[0044] (5)加入终止液：
[0045] 按照上述显色底物的加入顺序依次在每个检测孔中加入50μ1终止液，终止反应， 终止反应的表现为检测孔中的液体由蓝色快速转变成黄色。
[0046] 3、结果检测：
[0047]在加入终止液后15min内，用酶联仪在450nm的波长条件下检测每个检测孔的光密 度0D值，检测试剂盒的检测标准为：以标准品的浓度为纵坐标(或对数坐标），0D值为横坐标 (或对数坐标），使用curve expert 1.30软件绘出标准曲线(最佳方程式应依回归方程计算 的R2值来定，以R2值越趋近于1为好），计算样品的实际浓度。其中：阳性结果判断标准如表1 所示：
[0048]表1阳性结果判断标准
[0050] 实施例2、乳腺癌三联检诊断试剂盒的精确度试验
[0051] 本发明制备的包被96孔酶标板的变异系数CV值小于8%，对同一批次及不同批次 的检测试剂盒进行试验测试，测试结果显示批内及批间的试剂盒的CV值均小于8%，说明本 发明的乳腺癌三联检诊断试剂盒具有高精密性。
[0052] 实施例3、乳腺癌三联检诊断试剂盒的灵敏度试验
[0053] 采用CA125、HE4和p-her2标准品配制不同浓度的供试溶液，具体如表2所示：
[0054] 表2不同浓度的CA125、HE4和p-her2标准品供试溶液
[0055]
[0056] 由表2可知，采用实施例1制备的乳腺癌三联检诊断试剂盒测试各浓度供试溶液进 行测定，通过酶标仪进行检测，每个浓度测定3次。
[0057]结果表明，实施例1制备的乳腺癌三联检诊断试剂盒的灵敏度极佳，CA125的灵敏 度为<lU/ml，HE4的灵敏度为<3pmol/L，HCG的灵敏度为〈lIU/mL。
[0058]实施例4、乳腺癌三联检诊断试剂盒的稳定性试验
[0059] 1、将实施例1制备的乳腺癌三联检诊断试剂盒在室温下放置3、6和12个月，然后按 照实施例3的方法进行灵敏度测定。
[0060] 2、本实施例的对比例如下：
[0061] 对比例1:制备方法同实施例1，区别仅在于，抗体酶标板的制备过程采用的PBS缓 冲液的平pH值为8.0。
[0062]对比例2:制备方法同实施例1，区别仅在于，抗体酶标板的制备过程采用的PBS缓 冲液的平pH值为8.4。
[0063]对比例3:制备方法同实施例1，区别仅在于，所述血清稀释液为：人胰岛素6U/ML、 磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠3g/L、硫酸钠5g/L、氯化钠22g/L、脱氧胆酸钠12g/L，加水调节 pH值为6.4。
[0064]对比例4:制备方法同实施例1，区别仅在于，所述血清稀释液为：人胰岛素6U/ML、 磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠3g/L、硫酸钠5g/L、氯化钠22g/L、脱氧胆酸钠12g/L、EDTA-2K0 · 5g/L，加水调节pH值为6 · 0。
[0065]对比例5:制备方法同实施例1，区别仅在于，所述血清稀释液为：人胰岛素6U/ML、 磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠3g/L、硫酸钠5g/L、氯化钠22g/L、脱氧胆酸钠12g/L、EDTA-2K0 · 5g/L，加水调节pH值为6 · 8。
[0066] 3、试验结果
[0067] 试验结果如表3、表4和表5所示：
[0068]表3乳腺癌三联检诊断试剂盒存放3个月后的灵敏度结果
[0074] 由表3、表4和表5可知，本发明制备的乳腺癌三联检诊断试剂盒具有较好的的灵敏 度。
[0075] 本
【发明内容】
仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技 术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到 的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开 内容中具体记载一样。
【主权项】
1. 一种乳腺癌三联检诊断试剂盒，其特征在于，包括抗体酶标板、生物素抗体包被板、 牛血清白蛋白、血清稀释液、辣根过氧化物酶、四甲基联苯胺、硫酸、阴性对照液和阳性对照 液;所述酶标板抗体包括包被在酶标板上的抗CA125、HE4和p-her2单克隆抗体;所述生物素 抗体包被板包括包被在微孔板的生物素标记的CA125、HE4和p-her2单克隆抗体。2. 如权利要求1所述的乳腺癌三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述抗体酶标板的制备 方法为： 用pH为8.2的PBS缓冲液将抗CA125、HE4和p-her2单克隆抗体稀释至20-100μg/ml，按 100μΙ/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为2-8°C的条件下放置过夜，然后用洗涤液洗 涤，所述洗涤液为含有〇. 05 % Tween-20，pH为7.4的磷酸盐缓冲液，甩干，即得。3. 如权利要求1所述的乳腺癌三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述生物素抗体包被板 的制备方法为： 将CA125、HE4和p-her2单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的 生物素，得生物素 CA125、HE4和p-her2单克隆抗体；用pH为8.2的roS缓冲液将CA125、HE4和 p-her2单克隆抗体稀释至20-100μg/ml，按100μΙ/孔的加入量加于微孔板中，在温度为2-8 °C的条件下放置过夜，然后用洗涤液洗涤，所述洗涤液为含有0.05 % Tween 20，pH为7.4的 磷酸盐缓冲液，甩干，即得。4. 如权利要求1所述的乳腺癌三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液由以下 组分组成： 人胰岛素5-8U/ML、磷酸二氢钾2-4g/L、磷酸氢二钠2-4g/L、硫酸钠4-6g/L、氯化钠20-248/1、脱氧胆酸钠10-14 8/140了4-21(0.4-0.68/1，余量为水。5. 如权利要求4所述的乳腺癌三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液由以下 组分组成： 人胰岛素6U/ML、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠3g/L、硫酸钠5g/L、氯化钠22g/L、脱氧胆 酸钠 12g/L、EDTA-2K 0.5g/L，余量为水。6. 如权利要求4所述的乳腺癌三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液的pH值 为6.2-6.5。7. 如权利要求5所述的乳腺癌三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液的pH值 为 6.4。8. 如权利要求1所述的乳腺癌三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述四甲基联苯胺的浓 度为 0.4mg/ml。9. 如权利要求1所述的乳腺癌三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述硫酸的浓度为 2mol/L〇10. 如权利要求1所述的乳腺癌三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照液为不 含CA125、HE4和p-her2的正常人血清，所述阳性对照液为含有乳腺癌肿瘤标志物CA125、HE4 和p-her 2的乳腺癌患者血清。
【文档编号】G01N33/574GK105866418SQ201610388260
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】陈立国
【申请人】广州华弘生物科技有限公司