一种念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒，包括Mn包被的酶标板和抗Mn多克隆酶标抗体。本发明的试剂盒通过将Mn包被在酶标板上，将待检样本或标准抗原与包被抗原竞争结合有限的抗体结合位点，再经辣根过氧化物酶与底物发生显色反应，根据Mn标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算待检抗原的浓度值，本发明检测试剂盒具有较好的敏感性和特异性，结果与参比试剂符合率高，能提供更准确可靠的检验结果，所述试剂盒操作简便易行，检测快速灵敏，所用酶标仪简单、普及，价格低廉，本发明检测试剂盒为Mn定量检测提供了一种有效工具。
【专利说明】
一种念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与 应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种念珠菌甘露聚糖(Candida mannan，Mn) 抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD)或侵袭性真菌感染（invasive fungal infection，IFI)是指致病性真菌侵犯皮下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的 真菌感染性疾病。念珠菌属是机会真菌或条件致病真菌中最常见的真菌，它主要侵犯粘膜， 进一步可向血液中播散，引起播散性感染；它在真菌感染所致的侵袭性真菌病（invasive fungal sisease，IFD)中占首位。念珠菌属很容易在呼吸系统内繁殖，引发真菌性肺炎。而 真菌性肺炎的临床表现和细菌性肺炎的临床表现基本相同，易误诊为细菌性肺炎，使得真 菌感染进一步加重，甚至播散到全身。
[0003] 据统计侵袭性念珠菌病的归因病死率可高达47%，归因病死率在成人患者中为 15 %-25 %，在新生儿和儿童中为10%-15%。侵袭性念珠菌病可使ICU入住时间和住院时间 分别增加12.7d和15.5d。造成这种高死亡率的主要原因在于不能在病程早期对念珠菌病进 行检测诊断，以至患者得不到及时有效的治疗而死亡，因此选择早期检测诊断方法具有重 要的意义。
[0004]甘露聚糖(Mannan)是念珠菌细胞壁的主要抗原成分。对于念珠菌感染的诊断，除 了传统的培养方法外，测定血清中Μη，已经逐渐成为侵袭性念珠菌病早期诊断的简单、快捷 的方法，目前开展的检测方法主要有以下5大类：
[0005] (1)组织病理学检查，该法为有创性检查，不易取材；
[0006] (2)血培养方法，该法敏感性差，耗时长，易污染，有些真菌样本采集难，阳性检出 率不尚；
[0007] (3)直接镜检方法，该法可靠性低，局限性大，仅适合检测浅部真菌病；
[0008] (4)影像学检查，该法特异性差，在影像学上与血管侵袭性感染相似，不易区分。
[0009] (5)免疫学检测法:特异性针对Μη的抗体实现对念珠菌的检测，检测血液敏感性达 到80%以上。免疫学检测方法灵敏度和特异性都较前四种方法有明显的优势，正逐渐成为 念珠菌检测的常用方法。在国内外IFI的诊断标准中，均认为血清念珠菌抗原阳性可作为微 生物学诊断标准，因此测定血清中的Μη水平有助于念珠菌病的早期诊断、早期治疗。
[0010] 免疫检测技术是利用抗原抗体间能特异性结合反应，通过检测标记在反应物上的 标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测的方法。根据标记物的不同，分为酶联免疫分析 技术(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay,ELISA)、免疫焚光检测技术、化学发光免疫分 析技术、免疫微球技术、免疫胶体金技术等。其中ELISA技术具有操作简单，灵敏度高，检测 时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。
[0011] 在念珠菌的临床检测中，目前国际市场上免疫检测产品为数不多，现有的有美国 Bio-Rad公司的ELISA法检测试剂盒产品，该产品采用双抗夹心法，其方法是先将念珠菌的 特异单克隆抗体包被在酶标板上，再加入待检样本和辣根过氧化物酶(HRP)标记的同一单 克隆抗体，37 °C反应1.5个小时，待检样本中的抗原会与特异单克隆抗体结合并形成夹心结 构，再加入四甲基联苯胺(TMB)显色，颜色的深浅和待检抗原的浓度呈正相关，从而实现Μη 的检测。
【发明内容】
[0012] 在本发明的全文中，下述简写分别代表的术语是：
[0013] Μη-念珠菌甘露聚糖；
[0014] EDTA-乙二胺四乙酸二钠；
[0015] PBS-磷酸盐缓冲溶液；
[0016] SDS-十二烷基磺酸钠；
[0017] CBS-碳酸盐缓冲溶液；
[0018] Tirs-三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液；
[0019] BSA-牛血清白蛋白；
[0020] TMB-四甲基联苯胺；
[0021] HRP-辣根过氧化物酶；
[0022] 0D-在给定波长下的吸光度。
[0023] 对于EDTA、PBS、CBS、Tris、TMB的组成、浓度、pH等，均可采用免疫生物学上的常见 类型。
[0024] 本发明的目的是提供一种念珠菌甘露聚糖抗原提取方法。
[0025] 本发明的目的是提供一种念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒。
[0026] 本发明的另一个目的是提供上述曲念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备 方法。
[0027] 本发明的还一个目的是提供上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的应用。 [0028]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0029] -种念珠菌甘露聚糖抗原提取方法：
[0030] 1)白色念珠菌培养采用通用的白色念珠菌培养条件，具体地说培养基采用YM肉汤 培养基，成分为每升培养基含3g酵母提取物，5g蛋白胨，3g麦芽糖提取物，10g D-葡萄糖。培 养温度为30 °C，震荡速度为200rpm，培养时间大约28h。
[0031] 2)上述培养液进行离心，沉淀即白色念珠菌细胞用0.9wt %氯化钠洗涤两次，56 °C 加热2h杀死细胞，用丙酮干燥得到白色念珠菌菌粉。
[0032] 3)所得白色念珠菌菌粉在pH = 7.0,浓度为0.02M的柠檬酸盐缓冲液中高压灭菌 90min，离心，保留上清液，沉淀胶状物相同条件下灭菌，离心，合并上清液。
[0033] 4)上述上清液加入到甲醇中，出现沉淀;离心分离得到沉淀，沉淀溶于去离子水， 用去离子水透析，冻干，得到粗制甘露聚糖。
[0034] 5)粗制甘露聚糖溶于去离子水中，加入十六烷基三甲基溴化铵的水溶液，混合液 静止一段时间出现沉淀。
[0035] 6)离心分离沉淀，沉淀用去离子水洗涤，合并洗涤液和5)步上清液，合并液加入 lwt%的硼酸溶液。
[0036] 7)上述混合液边搅拌边加入2M氢氧化钠，调节pH至8.8，生成十六烷基三甲基溴化 铵-甘露聚糖络合物沉淀，收集沉淀，用pH= 8.8的0.5 %醋酸钠洗涤，然后用2%乙酸溶解， 所得溶液在乙醇中沉淀。
[0037] 8)离心，弃上清液，沉淀用2 %的醋酸乙醇溶液洗涤，溶于水后用2M氢氧化钠中和， 蒸馏水中透析，冻干，得到白色念珠菌甘露聚糖产物。
[0038]本发明中，白色念珠菌细胞经过柠檬酸盐处理后，上清液在甲醇中沉淀即可得到 甘露聚糖粗品，之后加入十六烷基三甲基溴化铵，其目的如下：1)中性条件下，出去蛋白质 和核酸；2)碱性条件下，和甘露聚糖结合形成络合物沉淀，纯化多糖。因此，本发明中，使用 十六烷基三甲基溴化铵来制备甘露聚糖，省略了凝胶层析的过程，不但使得制备工艺简单 化，同时能制备出高纯度的甘露聚糖。
[0039] -种念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒，包括Μη包被的酶标板和抗Μη多克隆酶 标抗体。
[0040] 进一步的，上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒还包括Μη标准品、样本处理 液、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液。
[0041 ]本发明的念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的工作原理如下：
[0042] 1)将Μη包被在固相载体上，制成固相抗原；
[0043] 2)将待检样本处理后与生物素标记的抗Μη多克隆酶标抗体加入1)的固相上，使待 检抗原与包被抗原竞争结合有限的抗体结合位点；
[0044] 3)经过恒温反应并彻底洗涤，加入HRP标记链亲和素；
[0045] 4)经过恒温反应并彻底洗涤，再加入酶的反应底物ΤΜΒ显色，颜色的深浅和待检样 本中Μη浓度呈负相关；
[0046] 5)用酶标仪在一定波长下测定吸光度，通过标准曲线实现对抗原浓度的检测。
[0047] 本发明所述Μη和抗Μη多克隆酶标抗体的相关技术信息如下：
[0048] 所述抗Μη多克隆抗体，可与Μη特异性结合，用SDS-PAGE显示为均一抗体产物，用Μη 包被，间接法ELISA检测显示其效价不低于1:1 X 105，所述抗体是由下述方法得到的：用Μη 作为免疫原免疫动物得到的血清进行分离纯化，得到抗体，所述纯化方法为饱和硫酸铵盐 析沉淀法和/或亲和层析法，其中，免疫方法可以为皮下注射、脾内注射、静脉注射或腹腔注 射，免疫剂量为〇. 3-2mL/只，免疫的动物为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪或驴，优选兔。
[0049] 上述抗Μη多克隆抗体的制备方法，具体步骤为：
[0050] (1)提取白色念珠菌甘露聚糖抗原；
[0051 ] (2)将白色念珠菌甘露聚糖抗原免疫动物。收集Μη抗原免疫的动物的颈动脉血，分 离抗血清；
[0052] (3)用饱和硫酸铵盐析沉淀法和/或亲和层析法进行初步纯化：
[0053]所述抗Μη多克隆抗体，是将上述纯化的抗Μη多克隆抗体用生物素进行标记。
[0054]在本发明中，所述的浓缩洗液，样本稀释液、样本处理液、底物溶液和终止液都是 免疫生物学实验领域常见试剂，其组成成分及配比如下：
[0055]浓缩洗液：按重量份数计氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠 42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份；
[0056] 酶标记物:HRP标记链亲和素；
[0057]样本稀释液:人工血清；
[0058] 样本处理液：可采取以下蛋白变性溶液(pH2-pH10): 0.05-0.2mol/L EDTA溶液； 0 · 07-0 · 2mo 1/L甘氨酸-HCL(甘氨酸-盐酸)溶液;0 · 05-15mg/mL链酶蛋白酶;0 · 01-0 · lmo 1/L SDS (十二烷基磺酸钠)溶液或lmo 1 /L-8mo 1 /L尿素；
[0059] 底物溶液:TMB;
[0060] 终止液:2mo 1 /L硫酸溶液。
[0061 ] 上述抗Μη多克隆抗体、以及Μη标准品a、Mn标准品b、Mn标准品c、Mn标准品d、Mn标准 品e、酶标记物、样本处理液、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液分别放入各个试剂 瓶中，上述各试剂瓶由海绵托架固定，并同Μη包被的酶标板和封板膜一同置于试剂盒盒体 内。
[0062]在本发明中，所述多个Μη标准品之间具有浓度差从而得以绘制标准曲线，优选的， 上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒，Μη标准品a的浓度为10ng/ml、Mn标准品b的浓度 为5ng/ml、Mn标准品c的浓度为2.5ng/ml、Mn标准品d的浓度为lng/ml、Mn标准品e的浓度为 0 · 5ng/ml〇
[0063]相应的，本发明公开了上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备方法，具 体步骤如下：
[0064] (1)制备酶标板
[0065] (a)Mn包被液的配制：采用以下缓冲溶液将Μη稀释至25ng/100yL-2yg/100yL: 0.01M-0.2M PBS，其ρΗ7·0-ρΗ8·0;0·05-0·2Μ CBS，其pH9.0-pH9.6;0.05mol/L Tris缓冲 液，其ρΗ10·0-ρΗ10·6;
[0066] (b)封闭液的配制:将3%_5%的脱脂奶粉或者1%_4%BSA加入下述缓冲溶液中， 配制成封闭液:缓冲溶液，〇 · 01M-0 · 2M PBS，其ρΗ7 · 0-pH8 · 0;
[0067] (c)包被酶标板：
[0068]①将配制的Μη包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入60yL-200yL包被液；
[0069] ②酶标板置于2-8°C环境下包被8-16h;
[0070] ③将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入60yL-200yL封闭液，置于37°C 温箱，30-90分钟；
[0071] ④从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37°C恒温30-90分钟，即得；
[0072 ] (2)标准品的制备(定量标准曲线的建立）
[0073] 标准品的制备是将Μη用人工血清配制而成，稀释浓度分别是10ng/ml，5ng/ml， 2·5ng/ml，lng/ml，0·5ng/ml;
[0074] (3)抗Μη多克隆酶标抗体溶液的配制：将生物素标记的抗Μη多克隆抗体用偶联物 稳定剂以1:2000-1:20000的比例稀释而成；
[0075] (4)HRP标记链亲和素溶液的配制:将HRP标记链亲和素用偶联物稳定剂以1: 2000- 1:20000的比例稀释而成；
[0076] (5)样本处理液的配制：分别用超纯水配制成以下pH 2-ρΗΙΟ的样本处理液:0.05- 0 · 2mol/L EDTA溶液;0 · 07-0 · 2mol/L甘氨酸-HCL(甘氨酸-盐酸)溶液;0 · 05-15mg/mL链酶蛋 白酶;0.01-0· lmol/LSDS溶液或lmol/L_8mol/L尿素；
[0077] (6)浓缩洗液（20X0.01M PBS)的配制：按重量份数称取氯化钠96.0份，氯化钾 2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000 份，混合均匀；
[0078] (7)样本稀释液为:人工血清；
[0079] (8)底物溶液为:TMB;
[0080] (9)终止液的配制:将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成2mol/L硫酸溶液的终止液。
[0081] 进一步的，本发明还公开了上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒在检测Μη浓 度方面的应用。
[0082] 优选的，上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测Μη浓度的应用采用竞争 ELI SA方法(一步法），包括Μη包被的酶标板，Μη免疫的兔源多克隆生物素标记抗体，Μη标准 品a，Μη标准品b，Μη标准品c，Μη标准品d，Μη标准品e，酶标记物、浓缩洗液，样本稀释液、样本 处理液、底物溶液和终止液，具体步骤如下：
[0083] a)取待检样本与样本处理液以1:1-5:1的体积比混合并煮沸l-10min后离心得到 待检测物；
[0084] b)将步骤a)的待检测物与生物素标记的抗Μη多克隆酶标抗体等体积混匀并加入 Μη包被的酶标板中同时孵育20-60min，孵育后洗板；
[0085] c)向步骤b)的酶标板中加入HRP标记链亲和素孵育20-60min，孵育后洗板；
[0086] d)向步骤c)的酶标板中加入TMB显色15min后，加入终止液后进行检测，于酶标仪 上读取450纳米处的吸光光度值。
[0087]与已有产品相比，本发明的技术区别在于：1、方法不同：Bio-Rad念珠菌菌试剂盒 采用双抗夹心法，本发明采用竞争法，先将Μη包被在酶标板上，再将待检样本或标准抗原与 包被抗原竞争结合有限的抗体结合位点，测定结果的颜色深浅和待检抗原的浓度呈负相 关。2、抗体不同：Bio-Rad念珠菌试剂盒采用的念珠菌单抗，本发明所用抗体为抗Μη多克隆 酶标抗体，可根据Μη标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算待检抗原的浓度值，该检测试 剂盒具有较好的敏感性和特异性，结果与参比试剂符合率高，能提供更准确可靠的检验结 果，所述试剂盒操作简便易行，检测快速灵敏，所用酶标仪简单、普及，价格低廉，该检测试 剂盒为Μη定量检测提供了一种有效工具。
【附图说明】
[0088]图1显示了多克隆抗体的SDS-PAGE检测的结果。
[0089]图2显示了多克隆抗体的效价测定的结果。
[0090]图3显示了 Μη试剂盒标准曲线图。
【具体实施方式】
[0091]实施例1抗Μη多克隆抗体的制备 [0092] 1.免疫动物
[0093]将白色念珠菌甘露聚糖抗原对3只成年雌性新西兰大白兔采用背部多点皮下注射 法进行免疫，免疫前1周去兔耳缘静脉血，分离血清作为阴性对照，免疫剂量为l.OmL/次，每 次免疫时加注l.OmL弗氏佐剂作为免疫佐剂，分别于初次免疫后第7、14、21和28天再加强免 疫一次。
[0094] 2.多克隆抗体的获得
[0095] 1)效价测定:经过3次免疫后，从兔子耳缘静脉取血，采血量为lmL/只，分离血清， 用间接ELISA法检测血清中的抗体效价。该多克隆抗体效价很高，大于1:1 X 105。
[0096] 2)分离抗血清：当兔子效价高于1:1 X 105时，用颈动脉放血的方法大量采血，取血 后在室温下放置约2h，然后4°C放置过夜使其凝固，2500rpm离心15min，取上清。
[0097] 3)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化
[0098] 1 ·饱和硫酸铵一次沉淀
[0099] 取17ml上述血清放入烧杯中，并加入等体积的生理盐水（17ml)，在搅拌器上搅拌， 缓慢滴加总体积50%的饱和硫酸铵(34ml)，搅拌3-5分钟，转到4°C冰箱内保存过夜。
[0100] 2.饱和硫酸铵二次沉淀及透析
[0101 ] (1)将一次沉淀的同一种血清蛋白分装在2个50ml离心管中，5000rpm离心15min;
[0102] (2)去上清液，向离心管内放入总体积60 % (10.27ml)的生理盐水，使之完全溶解， 在溶解过程中进行吹打，在缓慢滴总体积40 %加饱和硫酸铵(6.8ml )，不断震荡，转到4 °C冰 箱内保存，沉淀至少2.5小时。
[0103] (3)取2次沉淀后的血清溶液经离心机离心，5000rpm离心15min，去掉上清液。根据 沉淀量加入2_3ml高压PBS，进行吹打使之完全溶解，取透析膜，将溶解好的血清放入透析膜 中进行透析，转到4°C冰箱内保存。每隔2-3h换液一次，共换3-4次。
[0104] 3.用亲和层析法进行纯化
[0105] (1)称取Protein A Sepharose干粉100mg，经PBS 4°C过夜充分溶胀，装柱后用PBS 平衡。
[0106] (2)将透析后的多克隆抗体粗提物在4°C下反复过柱20次，过柱液保留。
[0107] (3)以0.01M PB 0.14M NaCl PH7.4充分淋洗柱子，至分光光度测定0D280约等于0 或0D280值基本不再降低。
[0108] (4)换0.1M甘氨酸-HC1 pH2.8洗脱，第一次500μ1，洗脱产物立即以约20μ1的1.0M Tris-HCl ρΗ9.0中和。洗脱液依次递减，收集洗脱产物。得到白色念珠菌多克隆抗体。
[0109] 实施例2抗Μη多克隆抗体的检测
[0110] 1 · SDS-PAGE 电泳检测
[0111] 对实施例1制得的抗体进行SDS-PAGE电泳，对得到的凝胶进行考马斯亮蓝染色。实 验结果见图1。由图中可看出，在25KD和50KD分子量区有清晰明显的条带，说明抗体纯度很 尚。
[0112] 2.效价测定
[0113] 用间接ELISA法对抗体效价进行测定。所用包被原为白色念珠菌甘露聚糖抗原，所 用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。检测结果见图2。从结果可看出，该多克隆 抗体效价很高，大于1:1 X 1〇5。
[0114] 实施例3念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0115] 一、酶标板的制备
[0116] 1、包被液的配制：
[0117] 所述的Μη包被液，采用0.01M PBS溶液将Μη稀释至25ng/100yL pH7.0-pH 7.4。
[0118] 2、封闭液的配制：
[0119] 1)所述的封闭液，采用0.01M PBS溶液，其pH7.0-pH7.4;
[0120] 2)将3%的脱脂奶粉加入上述溶液中，配制成封闭液。
[0121] 3、酶标板的包被方法：
[0122] 1)将配制的包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入60yL包被液；
[0123] 2)上述酶标板置于2_8°C环境下包被8h;
[0124] 3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入60yL封闭液，置于37°C温箱，30 分钟；
[0125] 4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37 °C恒温30分钟。
[0126]二、标准品的制备(定量标准曲线的建立）
[0127]标准品的制备是将Μη用人工血清配制而成，稀释浓度分别是10ng/ml，5ng/ml， 2·5ng/ml，lng/ml，0·5ng/ml〇
[0128] 三、抗Μη的多克隆生物素标记抗体溶液的配制
[0129] 抗Μη的多克隆酶标抗体溶液的配制是将生物素标记的抗Μη的多克隆酶标抗体用 偶联物稳定剂以1:2000的比例稀释而成。
[0130] 四、酶标记物的配制
[0131] HRP标记链亲和素溶液的配制是将HRP标记链亲和素用偶联物稳定剂以1: 2000的 比例稀释而成。
[0132] 五、样本处理液的配制
[0133] 可选用以下处理液：用超纯水溶解乙二胺四乙酸二钠，配制成0.05mol/L EDTA溶 液，pH 4·0-ρΗ4·8。
[0134] 六、浓缩洗液（20X0.01Μ PBS)
[0135] 浓缩洗液:氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢 钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份。
[0136] 七、样本稀释液
[0137] 人工血清。
[0138] 八、底物溶液
[0139] TMB〇
[0140] 九、终止液
[0141] 将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成2mol/L硫酸溶液作为终止液。
[0142] 实施例4念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0143] 所述的Μη包被液，采用0 · 1M PBS溶液将Μη稀释至25ng/100yL，ρΗ7 · 6-pH8 · 0，其余 步骤同实施例3。
[0144] 实施例5念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0145] 所述的Μη包被液，采用0 · 2M PBS溶液将Μη稀释至25ng/100yL，ρΗ7 · 6-pH8 · 0，其余 步骤同实施例3。
[0146] 实施例6念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0147] 所述的Μη包被液，采用0 · 05M CBS溶液将Μη稀释至25ng/100yL，ρΗ9 · 0-pH9 · 6，其余 步骤同实施例3。
[0148] 实施例7念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0149] 所述的Μη包被液，采用0 · 1M CBS溶液将Μη稀释至25ng/100yL，ρΗ9 · 0-pH9 · 6，其余 步骤同实施例3。
[0150] 实施例8念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0151] 所述的Μη包被液，采用0.2M CBS溶液将Μη稀释至25ng/100yL，pH9.0-pH9.6，其余 步骤同实施例3。
[0152] 实施例9念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0153] 所述的Μη包被液，采用0.05M Tris缓冲溶液将Μη稀释至25ng/100μL，pH10·0-pH10.6，其余步骤同实施例3。
[0154] 实施例10念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0155] 所述的Μη包被液，采用0.01Μ PBS溶液将Μη稀释至500ng/100yL，其pH7.2-ρΗ7.4。
[0156] 所述的的封闭液，采用0 · 1Μ PBS磷酸盐缓冲溶液，其ρΗ7 · 6-ρΗ8 · 0，将5%的脱脂奶 粉加入上述溶液中，配制成封闭液，
[0157] 其余步骤同实施例3。
[0158] 实施例11念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0159] 所述的的封闭液，采用0 · 2Μ PBS磷酸盐缓冲溶液，其ρΗ7 · 6-ρΗ8 · 0，将5%的脱脂奶 粉加入上述溶液中，配制成封闭液，
[0160] 其余步骤同实施例10。
[0161]实施例12念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0162] 所述的的封闭液，采用0 · 2Μ PBS磷酸盐缓冲溶液，其ρΗ7 · 6-ρΗ8 · 0，将1 %的BSA加 入上述溶液中，配制成封闭液，其余步骤同实施例10。
[0163] 实施例13念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0164] 所述的封闭液，采用0 · 2Μ PBS磷酸盐缓冲溶液，其ρΗ7 · 6-ρΗ8 · 0，将2 %的BSA加入 上述溶液中，配制成封闭液，其余步骤同实施例10。
[0165] 实施例14念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0166] 所述的封闭液，采用0.2Μ PBS PBS溶液，其ρΗ7·6-ρΗ8·0,将4%的BSA加入上述溶 液中，配制成封闭液，其余步骤同实施例10。
[0167] 实施例15念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0168] 所述的样本处理液可选用：用超纯水溶解乙二胺四乙酸二钠，配制成0.2mol/L m)TA溶液，pH 4.0-PH4.8。其余步骤同实施例10。
[0169] 实施例16念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0170] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解十二烷基磺酸钠，配制成0.01m〇l/L SDS 溶液，Ph8.5-pHl 0，其余步骤同实施例15。
[0171 ]实施例17念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0172] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解十二烷基磺酸钠，配制成0.05mol/L SDS 溶液，Ph8.5-pHl 0，其余步骤同实施例15。
[0173] 实施例18念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0174] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解十二烷基磺酸钠，配制成0. lmol/L SDS 溶液，Ph8.5-pHl 0，其余步骤同实施例15。
[0175]实施例19念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0176]样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解甘氨酸，配制成0.07mol/L甘氨酸，再用 浓HCL溶液调节pH至pH2.2-pH 2.8其余步骤同实施例15。
[0177]实施例20念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0178]样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解甘氨酸，配制成0.13mol/L甘氨酸，再用 浓HCL溶液调节pH至pH2.2-pH 2.8其余步骤同实施例15。
[0179]实施例21念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0180]样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解甘氨酸，配制成0.2mol/L甘氨酸，再用浓 HCL溶液调节pH至pH2.2-pH 2.8其余步骤同实施例15。
[0181 ]实施例22念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0182] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解链酶蛋白酶，配制成0.05mg/mL链酶蛋白 酶溶液，PH8. Ο-pH 9.0，其余步骤同实施例15。
[0183] 实施例23念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0184] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解链酶蛋白酶，配制成5mg/mL链酶蛋白酶 溶液，PH8. Ο-pH 9.0，其余步骤同实施例15。
[0185] 实施例24念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0186] 样本处理液的配制方法为:用超纯水溶解链酶蛋白酶，配制成15mg/mL链酶蛋白酶 溶液，PH8. Ο-pH 9.0，其余步骤同实施例15。
[0187] 实施例25念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0188] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解尿素，配制成lmol/L尿素，pH7.2-pH8.0， 其余步骤同实施例15。
[0189] 实施例26念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0190] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解尿素，配制成4mol/L尿素，pH7.2-pH8.0， 其余步骤同实施例15。
[0191 ]实施例27念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0192] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解尿素，配制成8m〇VL尿素，pH7.2-pH8.0， 其余步骤同实施例15。
[0193] 实施例28Mn免疫检测试剂盒检测步骤
[0194] 一、样本的处理
[0195] 1)将待检样本与样本处理液以3:1的体积比混合后沸水浴5min。
[0196] 2)将水浴后的混合液5,000g离心5min。
[0197] 3)离心后上清液用于检测。
[0198] 二、检测步骤
[0199] 1)取出已预包被抗原的96孔酶标板；
[0200] 2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20 X (1份浓缩洗液（20X0.01M roS)加19份的 无菌去离子水或超纯水）；
[0201 ] 3)加样:分别设标准曲线组、待测样品组，其中
[0202] 标准曲线组:各标准曲线点(0 · 5ng/ml_10ng/ml)
[0203] 待测样本组:处理后的待测样本
[0204]将两组分别与抗Μη生物素标记抗体等体积加入酶标板孔中，在37°C下孵育40min; [0205] 5)洗涤:甩掉反应液，每孔每次加入不少于300yL的洗液，静置40s后拍干，重复上 述洗涤操作，共洗涤3次；
[0206] 6)加样:将酶标记链亲和素加入酶标板孔中，在37°C下孵育40min;
[0207] 7)洗涤:甩掉反应液，每孔每次加入不少于300yL的洗液，静置40s后拍干，重复上 述洗涤操作，共洗涤3次；
[0208] 8)显色:洗涤结束后，每孔加入底物溶液80yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0209] 9)终止:每孔内加入50yL终止液，混匀后，在0D450nm处读数；
[0210] 10)结果判断:在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算 软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中Μη的浓度值。
[0211] 实施例34试剂盒的临床应用(应用了实施例10的试剂盒和实施例28的检测步骤）
[0212] Μη免疫检测试剂盒参考值的确定
[0213] 临床确诊为念珠菌感染阳性样本60例，同时检测正常人样本300例，测定0D450值， 根据标准曲线(表1，图3)计算抗原浓度值(表2)，最终确定参考值判断标准(表3)。
[0214] 表1检测标准曲线
[0216] 表2Μη免疫检测试剂盒参考值的确定ELISA临床检测结果
[0217]
[0218] 注表示与正常人比较p〈〇.〇l;
[0219] 表3
[0220]
[0221] 如果样本的检测结果落在可疑区间，则需要进行第二次检测。
[0222] 根据标准曲线的结果计算检测抗原的浓度，通过检测300例正常人样本，取95%置 信区间的抗原的浓度值为Cut-off上限：^ (平均值)+2s(标准偏差）=0.5+2*0.25 = 1.0，通 过检测60例阳性病人，取95%置信区间的抗原的浓度值为Cut-off下限：i(平均值）一2s (标准偏差）=2· 5 -2*0·9 = 0· 7，抗原的浓度值在0· 7ng/ml-l ·Ong/ml之间为疑似病人。
[0223] 实施例35试剂盒的方法学考察（应用了实施例22的试剂盒和实施例32的检测步 骤）
[0224] 1、敏感性实验
[0225] 收集临床确诊样本20例进行检验。
[0226] 诊断敏感性=阳性样本检出例数/阳性样本总例数X 100%，由实验结果说明本实 验的敏感性在85%以上。
[0227] 表4敏感性检测实验结果
[0230] 2、特异性实验
[0231] 检测20例健康人样本。
[0232] 特异性=阴性样本检出例数/阴性样本总例数X 100%，由实验结果说明本实验的 敏感性在90%以上。
[0233] 表5特异性检测实验结果
[0236] 3、回收率实验
[0237] 选择正常人血液添加念珠菌甘露聚糖抗原2yg/L、3yg//L后检测，计算真实值与期 望值的比值，得到回收率。回收率介于80-120%之间认为合格。由实验结果说明本实验的回 收率介于80%-120%之间，回收率良好。
[0238] 表6回收率结果实验
[0240] 4、重复性实验
[0241] 1)批间精密度
[0242] 合格标准:将同一标本每天一次测试，连续10个工作日，计算其均值M、标准差SD与 变异系数CV，变异系数CV < 25 %为合格。结论:本产品批间精密度（即变异系数CV)为24%， 小于25%，符合标准，证明本产品批间精密度良好。
[0243] 表7批间精密度结果实验
[0245] 2)批内精密度
[0246] 合格标准:将同一标本在同一批次实验中平行测定10组数据。计算其均值M、标准 差SD与变异系数CV，变异系数CV < 15%为合格。本产品批内精密度(即变异系数CV)为14%， 小于15%，符合标准，验证合格。
[0247] 表8批内精密度结果实验
[0249] 5、稳定性实验
[0250] 将组装好的试剂盒在37 °C环境中放置，每天做标准曲线检测已知浓度的抗原溶 液，连续检测5天，检测值变化率（即变异系数CV)小于20%，证明试剂盒稳定。其结果显示5 天的变异系数CV < 20%，说明本发明稳定性良好。
[0251 ]表9稳定性试验结果
[0252]
[0253] 上述【具体实施方式】是对本发明念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方 法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个 实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒，其特征在于:包括Μη包被的酶标板和抗 Μη多克隆生物素标记抗体。2. 根据权利要求1所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒，其特征在于:还包括Μη 标准品、样本处理液、酶标记物、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液。3. 根据权利要求2所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒，其特征在于:各组分组 成及配比如下： 浓缩洗液:按重量份数计氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份， 磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份； 样本稀释液:人工血清； 样本处理液:可采取以下蛋白变性溶液，其ρΗ2-ρΗ10，0.05-0.2mo 1/L EDTA溶液;0.07-0 · 2mol/L甘氨酸-HCL溶液;0 · 05-15mg/mL链酶蛋白酶;0 · 01-0 · lmol/L SDS溶液或lmol/L-8mol/L 尿素； 底物溶液:TMB溶液； 终止液:2mol/L硫酸溶液。4. 根据权利要求2所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒，其特征在于:多个Μη标 准品之间具有浓度差。5. 权利要求1-4之一所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备方法，其特征 在于:具体步骤如下， (1) 制备酶标板 (3)111包被液的配制：采用以下缓冲溶液将血稀释至25叫/10(^1^-2以8/10(^1^0.0謂- 0.21卩85，其？!17.0-?!18.0;0.05-0.21〇85，其？!19.0-?!19.6;0.05111〇1/11^8缓冲液，其 ρΗ10.0-ρΗ10.6； (b) 封闭液的配制:将3%-5%的脱脂奶粉或者1%-4%BSA加入缓冲溶液中配制成封闭 液;其中缓冲溶液为〇 · 01M-0 · 2M PBS，其ρΗ7 · 0-pH8 · 0; (c) 包被酶标板： ① 将配制的Μη包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入60yL-200yL包被液； ② 酶标板置于2_8°C环境下包被8-16h; ③ 将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入60yL-200yL封闭液，置于37°C温箱， 30-90分钟； ④ 从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37°C恒温30-90分钟，即得； (2) 标准品的制备 标准品采用Μη用人工血清配制而成，稀释浓度分别是500ng/ml-0. lng/ml; (3) 抗Μη多克隆生物素标记抗体溶液的配制:将生物素标记的抗Μη多克隆酶标抗体用 偶联物稳定剂以1:2000-1:20000的比例稀释而成； (4) HRP标记链亲和素溶液的配制：将HRP标记链亲和素用偶联物稳定剂以1: 2000-1: 20000的比例稀释而成； (5) 样本处理液的配制：分别用超纯水配制成以下pH2-pH10的样本处理液Α.Οδ-Ο · 2mol/L EDTA 溶液； 0 · 07-0 · 2mol/L 甘氨酸-HCL 溶液； 0 · 05-15mg/mL 链酶蛋白酶； 0 · 01-0 · lmol/L SDS溶液或lmol/L_8mol/L尿素； (6) 浓缩洗液(20 X 0.01M roS)的配制：按重量份数称取氯化钠96.0份，氯化钾2.40份， 十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份，混合均 匀； (7) 样本稀释液为:人工血清； (8) 底物溶液为:TMB溶液； (9) 终止液的配制:将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成2mol/L硫酸溶液作为终止液。6. 根据权利要求5所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在 于:所述抗Μη多克隆抗体的制备包括下述步骤： (1) 提取白色念珠菌甘露聚糖抗原； (2) 将白色念珠菌甘露聚糖抗原免疫动物，收集Μη抗原免疫的动物的颈动脉血，分离抗 血清； (3) 用饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析法进行纯化。7. 权利要求1-4之一所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒在检测Μη浓度方面的 应用。8. 根据权利要求7所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测Μη浓度的应用，其 特征在于采用竞争ELISA方法，包括Μη包被的酶标板，Μη标准品，浓缩洗液，样本稀释液、样 本处理液、底物溶液和终止液，具体步骤如下： a) 取待检样本与样本处理液以1:1-5:1的体积比混合并煮沸l-10min后离心得到待检 测物； b) 将步骤a)的待检测物与辣根过氧化物酶标记的抗Μη多克隆酶标抗体等体积混匀并 加入Μη包被的酶标板中同时孵育20-60min，孵育后洗板； c) 向步骤b)的酶标板中加入TMB显色15min后，加入终止液后进行检测，于酶标仪上读 取450纳米处的吸光光度值。
【文档编号】G01N33/569GK105866409SQ201610496020
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】彭洁, 刘春龙, 李宁, 粟艳, 周泽奇
【申请人】丹娜（天津）生物科技有限公司