L-15、500 ~2000IU/ml IFN- γ、50~500ng/ml anti-⑶3-McAb中的一种或多种任意比混合。其它与 一相同。
[0041]
【具体实施方式】十：本实施方式与【具体实施方式】一不同的是：细胞因子为50~ 500ng/ml anti-CD3_McAb、500 ~2000IU/ml IFN_y、0.5 ~4ng/ml IL_la、l〇〇〇 ~ 4000IU/ml IL-2和0. 25~2ng/ml IL-7按任意比混合。其它与【具体实施方式】一相同。 [0042] 本
【发明内容】
不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个【具体实施方式】的组 合同样也可以实现发明的目的。
[0043] 通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0044] 实施例1 PBMC的分离制备：
[0045] 1.离心收集样本血衆，并水浴灭活，离心收集血浆上清液，每10ml分装一 支，-80°C保存，备用；
[0046] 2.采用淋巴细胞分离液分离血细胞中的单个核细胞，并收集单个核细胞；
[0047] 3.用复方电解质溶液洗涤细胞两次，以彻底去除淋巴细胞分离液，收集细胞最后 一次洗涤的上清液，并进行细菌、真菌、支原体和内毒素检测。离心收集的细胞待用；
[0048] 实施例2 PBMC的冻存：
[0049] 1.配制细胞冻存液：按照细胞无血清培养基、人血白蛋白和DMS0按照4:5:1的体 积比混合而成；
[0050] 2、用配置好的细胞冻存液将收集的PBMC混合均匀，并调整细胞浓度为1 X 107个/ ml ；
[0051] 2.将细胞悬液分装到1. 8ml冻存管中，并抽样进行病毒、细菌、真菌、支原体和内 毒素检测，将细胞冻存管放入程序降温盒，-80°C暂时保存。带所有监测结果合格后，将细胞 入库，封存在液氮中做长期保存。
[0052] 实施例3 PBMC的复苏及培养：
[0053] 1.将液氮中取出的冻存管室温平衡lmin后，快速转移至37°C水浴锅中融化细 胞；
[0054] 2.将融化后的细胞悬液转移至离心管中，并添加细胞洗涤液，离心收集细胞，共进 行两次清洗；
[0055] 3.用培养基重悬细胞，并吹打均匀，使细胞充分分散开，（以CIK细胞培养为例） 接种于培养瓶中，并添加人自体血浆上清，使血浆浓度达到5%，并添加干扰素 γ，使其终 浓度为 4000IU/ml ;
[0056] 4.接种24小时后，添加抗⑶3抗体，使其终浓度为1 μ g/ml，添加白介素2,使其终 浓度为 4000IU/ml ;
[0057] 5.根据培养情况随时添加培养基（白介素2,1000IU/ml，自体血浆0· 5% );
[0058] 6.培养14天后收获细胞分别进行流式、细菌、真菌、革兰氏、支原体和内毒素检 测。；
[0059] 为证明免疫细胞储存的有效性，分别对细胞复苏后的活率（见图2)，回收率，CIK 扩增倍数（见图3)、CIK流式指标（见表1)和CIK体内杀瘤性检测和CIK体外杀瘤性检测 (见表2)。
[0060] 表1效应细胞的阳性比率统
[0062] 表2 MTT法进行体外杀瘤性实验的结果
[0063]
[0065] 体外杀瘤性实验的靶细胞为K562。K562的培养条件为10% FBS的RPMI-1640培 养基，37°C，5% C02。从本实施例2中冻存的四个批次的样本中随机选取10组细胞，按照实 施例3所述实验方法进行复苏和CIK的诱导北洋，组别分别标记为1-10。将K562接种于 96孔板中，每孔接种细胞5 X 103个。待K562完全贴壁后，取培养成熟的CIK，并离心获得 细胞，采用10 % FBS的RPMI-1640培养基将细胞沉淀重悬，并调整细胞密度为5 X 104 (效应 细胞：靶细胞为20 :1)个/ml，每个组别选择5个孔，并做好标注，弃掉其中的培养基，添加 重悬好的CIK细胞悬液，每孔添加200 μ 1。并在6h采用MTT测其吸光值（0D570nm)，并按 照下述公式计算其杀瘤性：
[0066] 杀伤率=[(空白组0D值一实验组0D值）/空白组0D值]X 100 %。
[0067] 体外杀瘤性结果见表2。
[0068] 体内杀瘤性实验选用30只裸鼠，雌性，体重15-18g，5周龄。将K562细胞用生理盐 水悬浮，调整细胞浓度为2X 105/ml，每只裸鼠注射细胞体积为lml，即2X 105个细胞。在无 菌条件下，将制备好的肿瘤细胞悬浮液接种于裸鼠左腋下。将裸鼠随机分为十组，标为1-10 组，另外选取三只裸鼠为对照组，仅进行肿瘤细胞和生理盐水的注射。收获的CIK注射方式 为尾缘静脉注射，注射细胞数为2 X 106个细胞。小鼠培养至20天时进行解剖，获得肿瘤组 织并称重。并按照下述公式计算其抑癌率：
[0069] 抑癌率=[(对照组肿瘤重量一实验组肿瘤重量）/对照组肿瘤重量]X 100%。
[0070] 体内杀瘤性实验结果见表3。
[0071] 表3 CIK体内杀瘤性实验结果
[0072]
[0074] 综上，本发明提供了一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法。针 对目前的健康人群提供了一项"免疫细胞生命银行"的保障。在未来10年内，肿瘤人群还 将由于环境和饮食的问题持续翻倍增长。面对肿瘤对生命及健康的挑战，本发明未雨绸缪， 关键时刻将给予强力回击，以期将肿瘤扼杀在摇篮之中。
[0075] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，其特征在于它是按照以下 步骤进彳丁的： 一、 对采集到的成人外周静脉血进行分离纯化，获得外周血单个核细胞； 二、 对得到的外周血单个核细胞进行清洗，纯化； 三、 用冻存液重悬外周血单个核细胞进行稀释，使细胞悬液密度达到1~10X107个/ mL； 四、 将稀释后的细胞悬液分装至1.8mL冻存管中，每管添加lmL，并留样待检，将细胞冻 存管放入4°C预温的程序降温盒中，转移到_80°C冰箱暂时储存； 五、 预留的冻存细胞悬液进行细菌、真菌、内毒素和支原体等指标的检测，指标检测合 格后，冻存入库做长期保存； 六、 复苏时，将从冻存入库中取出的细胞转入预温至_80°C的冻存盒内后，平衡5min转 入37 °C水浴融化； 七、 将融化后的细胞转移至含质量百分含量为10 %人血白蛋白的生理盐水混合液中洗 涤，检测细胞活率，之后将细胞重悬于含有质量百分含量为10%人血白蛋白的无血清培养 体系中接种培养，即完成所述的长期储存成人外周血单个核细胞复苏培养过程。2. 根据权利要求1所述的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，其 特征在于步骤一中获得外周血单个核细胞的方法为：离心收集成人外周静脉血细胞沉淀， 离心收集血浆上清液并水浴灭活，每10mL分装一支，-80°C保存，备用；采用淋巴细胞分离 液分离血细胞中的单个核细胞，并收集单个核细胞。3. 根据权利要求1所述的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，其 特征在于步骤二中对得到的外周血单个核细胞进行清洗，纯化的具体操作如下：用复方电 解质溶液洗涤单个核细胞两次，收集最后一次洗涤的上清液，并进行细菌、真菌、支原体和 内毒素检测，检测合格后，离心收集的细胞待用。4. 根据权利要求1所述的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，其 特征在于步骤三中的冻存液配制如下：按细胞无血清培养基、人血白蛋白和DMS0的体积比 为4:5:1的比例混合而成。5. 根据权利要求4所述的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，其 特征在于冻存液中的人血白蛋白的质量分数至少为10 %。6. 根据权利要求1所述的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，其 特征在于步骤五中指标检测合格是指：细菌、真菌、支原体检测皆为阴性，内毒素含量不高 于 0. 25EU/mL。7. 根据权利要求1所述的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，其 特征在于该方法所用试剂为医用或药用级别。8. 根据权利要求1所述的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，其 特征在于步骤七中无血清培养体系中含有单克隆抗体和细胞因子；其中，单克隆抗体的在 无血清培养体系中的浓度为500ng/mL。9. 根据权利要求8所述的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，其 特征在于细胞因子为浓度 20 ~100ng/mlGM-CSF、0. 5 ~4ng/mlIL-1α、1〇〇〇 ~4000IU/ mlIL_2、5 ~30ng/mlIL_4、0. 25 ~2ng/mlIL_7、0. 2 ~2ng/mlIL_12、0. 25 ~2ng/ml IL-15、500 ~2000IU/mlIFN-γ、50 ~500ng/mlanti-CD3-McAb中的一种或多种任意比混 合。10.根据权利要求9所述的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法， 其特征在于细胞因子为 50 ~500ng/mlanti-CD3-McAb、500 ~2000IU/mlIFN-γ、0· 5 ~ 4ng/mlIL-1α、1000 ~4000IU/mlIL-2 和 0· 25 ~2ng/mlIL-7 按任意比混合。
【专利摘要】一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，它涉及成人外周血单个核细胞的分离及其冻存和复苏方法。方法：一、采血袋采集健康成人外周静脉血，并对其中单个核细胞进行分离纯化；二、通过添加冻存细胞所须相关冻存试剂，将分离得到的单个核细胞按照一定密度进行冻存；三、随机抽样对细胞冻存混合液进行细菌、真菌、内毒素和支原体检测；四、复苏细胞并重悬于特殊配制的细胞复苏洗液中，离心清洗两次后进一步培养。由于本发明使用的外周血单个核细胞来源于患者自身，实验用到的相关试剂均无外源性物质，不存在涉及相关伦理问题，回输后不会产生免疫排斥反应。本发明用于健康成人免疫细胞的存储，为日后进行肿瘤类相关疾病的治疗做储备。
【IPC分类】C12N5/078, A01N1/02
【公开号】CN105316287
【申请号】CN201510897642
【发明人】张怡, 兰凤翔, 李琳, 刘艳青
【申请人】黑龙江天晴干细胞股份有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年12月8日