用于前列腺细胞培养的前列腺细胞外基质凝胶的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种用于前列腺细胞培养的前列腺细胞外基质凝胶。
【背景技术】
[0002]细胞培养技术也叫细胞克隆技术，是生物技术领域最核心、最基础的技术。细胞培养的一般过程包括1)准备工作:器皿的清洗、干燥、消毒、培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌、无菌室或超净台的清洁与消毒、培养箱及其他仪器的检查与调试等；2)取材:无菌环境下从机体取出组织细胞，处理后接入培养器皿中；3)培养:将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。培养中的细胞应每隔一段时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的pH是否太酸或太碱，此外对培养温度和C02浓度也要定期检查；4)冻存及复苏。在生命科学基础领域，对于细胞的培养，人们关注的不仅仅是它们的分裂生长，更为重要的是它们经过传代后能否维持体内的形状。
[0003]由于细胞是在体外改变的环境下增生，所以利用现有技术培养细胞，细胞丧失了原有的性状。利用现有技术培养细胞，细胞呈平面生长模式，细胞在培养基表面生长，并且只会沿着培养基的平面延伸，这与哺乳动物机体内细胞生长生理状态不相符合，难以模拟细胞在哺乳动物机体内的自然生长环境，这就与人们进行细胞培养的初衷相违背了。且细胞进入增殖期较快，增殖期较短，一周内达到高峰，然后进入平台期。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于前列腺细胞培养的前列腺细胞外基质凝胶。该前列腺细胞外基质凝胶呈白色半透明状，具有良好的生物相容性；利用该前列腺细胞外基质凝胶培养人体前列腺上皮细胞，细胞呈簇状三维立体空间生长模式，这与哺乳动物机体内细胞生长生理状态相一致，能够更好地模拟细胞在哺乳动物机体内的自然生长环境。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0006]用于前列腺细胞培养的前列腺细胞外基质凝胶，其制备方法包括以下步骤:
[0007]A.前列腺细胞外基质的制备:无菌条件下取雄性成年哺乳动物膀胱组织切片，切片的规格为lcmX lcmX0.5cm ;取切片10片，加入5_15mL浓度为9-llkIU/mL的抑肽酶溶液，于4°C条件下搅拌45-55h ;接着在5-10mL质量分数为0.85-1.2%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中于4°C条件下搅拌20-30h ;然后在5-10mL质量分数为0.75-1.5%的十二烷基硫酸钠溶液中于4°C条件下搅拌20-30h ;再在5-15mL DNA水解酶的浓度为45_55U/mL、RNA酶A的浓度为0.5-1.5U/mL的溶液中在4°C条件下搅拌20_28h ;用1XPBS缓冲液清洗三次，每次5min，冷藏、冻干并通过10_15kGy Co6°福照杀菌，并置于_20°C条件下存放；
[0008]B.前列腺细胞外基质凝胶的制备:将步骤A所得样品于-80°C冷冻，然后用冷冻研磨机研磨45-60h成为粉末，取lg研磨后粉末和lOOmg胃蛋白酶混合在100mL的0.0lmol/L盐酸溶液中，室温搅拌40-55h，将混合物在4°C条件下移至离心管中，在转速3000r/min条件下离心15min ;收集上清液，过滤，取过滤后溶液置于_80°C条件下储存直至进一步使用；再在4°C条件下加入15mL 10 X PBS缓冲液，用0.01nmol/L NaOH溶液将过滤后溶液的pH值调至7.4，置于37°C条件下孵育30min得到前列腺细胞外基质凝胶。
[0009]所述细胞外基质(ECM)是动物细胞合成并分泌到细胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节细胞的生理活动。所述凝胶是组织工程材料的重要组成部分，具有网状多空的空间结构，能保持一定的形状，性质柔软，富含水分，利于细胞生长所需的氧气和营养物质的传递和运输。目前尚未有利用哺乳动物前列腺组织制备凝胶来进行细胞培养的相关报道，这是本发明的一个创新点所在。且由于前列腺组织来自生物机体内，以前列腺组织制备的凝胶来进行细胞培养，更贴近体内环境，能够更好的模拟细胞在体内的自然生长环环境。
[0010]进一步，步骤A中所述抑肽酶溶液的浓度为10kIU/mL，体积为8mL，在该溶液中的搅拌时间为48h。所述抑肽酶别名抑胰肽酶、屈来密多、胰蛋白酶抑制剂，是一种非特异性血清蛋白酶抑制剂，具有保护血小板、抑制纤溶蛋白的作用。抑肽酶是细胞培养系统中的保护剂，在中性和酸性环境下稳定，耐高温，耐蛋白水解酶降解。它对一些丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)有抑制能力。
[0011]进一步，步骤A中所述聚乙二醇辛基苯基醚溶液的质量分数为1 %，体积为5mL，在该溶液中的搅拌时间为24h。
[0012]进一步，步骤A中所述十二烷基硫酸钠溶液的质量分数为1 %，体积为7.5mL，在该溶液中的搅拌时间为24h。所述十二烷基硫酸钠为一种无毒的阴离子表面活性剂，具有良好的乳化、发泡、渗透、去污和分散性能。
[0013]进一步，所述DNA水解酶和RNA酶A的浓度分别为50U/mL和lU/mL，该含有DNA水解酶和RNA酶A的溶液的体积为10mL，在该溶液中的搅拌时间为24h。所述DNA水解酶用于切断磷酸二酯键的酶，这些酶使糖-磷酸酯主链上的磷酸二酯键水解。所述RNA酶A是一类催化RNA降解的核酸酶。
[0014]进一步，步骤A中所述Co6°辐照杀菌的强度为12kGy。所述辐照杀菌耗能低，与传统的方法相比，可节省能源几倍到十几倍；射线穿透力强，可杀灭各种包装、散装、固体、液体表面及内部的各种微生物和害虫；辐照加工属于冷加工，不会引起内部温度的明显增加，同时它又是物理加工，不需要添加任何化学药剂，没有农药残留，也不发生放射性，不污染环境。
[0015]进一步，步骤B中所述过滤步骤所用过滤器为0.2mm的针头式过滤器。所述枕头式过滤器外壳材料选用优质卫生级聚丙烯材料，产品结构设计精密，保证了过滤的流畅，内部空间合理化，残留率非常低，从而减少了样品的浪费。
[0016]本发明的目的之二在于保护所述前列腺细胞外基质凝胶的使用方法，该使用方法包括以下步骤:将1 X 104个前列腺细胞与100 μ L前列腺细胞外基质凝胶混合均匀，加入24孔板孵育30min，然后加入培养基，在C02体积分数为5 %、空气体积分数为95 %的气体环境进行培养，每2天更换培养基1次。所述前列腺细胞的个数通过计数实现。
[0017]进一步，所述培养基为角质形成细胞无血清培养基。所述角质形成细胞无血清培养基为无血清培养基的一种。无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。一般由基础培养基和替代血清的补充因子组成。无血清培养基中未添加血清，但含有个别蛋白或大量蛋白组分。无血清培养基具有以下优势:1)未知组分少；2)培养基中不存在血清中的抗体、补体等成分，对培养细胞影响小；3)杂蛋白含量少，生产的产品后期处理较容易；4)无血清培养可以实现细胞的大规模悬浮培养，增加培养液的利用率。
[0018]本发明的目的还在于提供所述前列腺细胞外基质凝胶在人体前列腺上皮组细胞培养中的应用。
[0019]本发明的有益技术效果是:
[0020]本发明的前列腺细胞外基质凝胶呈白色半透明状，具有良好的生物相容性；利用该前列腺细胞外基质凝胶培养人体前列腺上皮细胞，细胞呈簇状三维立体空间生长模式，这与哺乳动物机体内细胞生长生理状态相一致，能够更好地模拟细胞在哺乳动物机体内的自然生长环境；且增殖期较长(11天)，比利用现有技术所培养的细胞增殖期延长了 6天。
【附图说明】
[0021]图1A为实施例3得到的前列腺细胞外基质的苏木精-伊红染色结果显示图；
[0022]图1B为实施例3得到的前列腺细胞基质的扫描电镜结构；
[0023]图1C为实施例3制备的前列腺细胞外基质凝胶；
[0024]图2A为实施例4对照组所培养的细胞(培养5天)生长状态；
[0025]图2B为实施例4实验组所培养的细胞(培养5天)生长状态；
[0026]图3中2D为实施例4对照组所培养的细胞生长曲线，图3中3D为实施例4实验组所培养的细胞生长曲线。
【具体实施方式】
[0027]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的实施例进行详细的描述。
[0028]实施例1
[0029]用于前列腺细胞培养的前列腺细胞外基质凝胶，该前列腺细胞外基质凝胶的制备方法包括以下步骤:
[0030]A.前列腺细胞外基质的制备:无菌条件下取雄性成年哺乳动物膀胱组织切片，切片的规格为lcmXlcmX0.5cm ;取切片10片，加入5mL浓度为llkIU/mL的抑肽酶溶液，于4°C条件下搅拌55h ;接着在5mL质量分数为1.2%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中于4°C条件下搅拌20h ;然后在10mL质量分数为0.75%的十二烷基硫酸钠溶液中于4°C条件下搅拌30h ;再在5mL DNA水解酶的浓度为45U/mL、RNA酶A的浓度为1.5U/mL的溶液中在4°C条件下搅拌20h ;用1XPBS缓冲液清洗三次，每次5min，4°C条件下冷藏，再在真空条件下冷冻干燥并通过10-15kGy Co6°辐照杀菌，并置于_20°C条件下存放；所述真空条件下冷冻干燥的温度为_10°C，真空度为12Pa ;
[0031]B.前列腺细胞外基质凝胶的制备:将步骤A所得样品于_80°C冷冻，然后用冷冻研磨机研磨45h成为粉末，取lg研磨后粉末和lOOmg胃蛋白酶混合在lOOmL的0.01mol/L盐酸溶液中，室温搅拌55h，将混合物在4°C条件下移至离心管中，在转速3000r/min条件下离心15min ;收集上清液，过滤，取过滤后溶液置于-80°C条件下储存直至进一步使用；再在4°C条件下加入15mL 10\