一种高效分离纯化乳腺上皮细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物细胞的体外分离纯化方法，尤其是涉及一种体外高效分离纯化动 物乳腺上皮细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 乳腺最主要的功能就是泌乳，乳腺上皮细胞是乳腺中唯一具有分泌功能的细胞， 是研究乳腺泌乳机制的着手点。乳腺上皮细胞的增殖和分化始终贯穿于乳腺发育及泌乳过 程，因此，在细胞水平上进行乳腺上皮细胞增殖及分化的调控研究是十分有意义的。乳腺上 皮细胞的体外分离培养由于其细胞成分均一，脱离了体内复杂环境的干扰，被广泛应用于 乳腺的发育机制、乳汁的分泌机制、乳腺生物反应器的构建和乳腺癌发生机制的研究中。
[0003] 乳腺上皮细胞的体外分离方法主要有组织块法、酶消化法、机械法及从初乳中分 离乳腺上皮细胞。组织块法，操作简单，对细胞形态功能影响较小，但是分离所需时间较长； 酶消化法，可以快速获得细胞，但往往影响上皮细胞的形态功能，特别是泌乳功能；同时，这 两种方法都需要一个漫长的纯化过程，才能得到均一的乳腺上皮细胞。因此，需要进一步研 究乳腺上皮细胞的体外分离纯化技术，期待发明一种既能快速高效得到均一纯化的乳腺上 皮细胞，同时对乳腺上皮细胞形态和特异性泌乳功能影响较小的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有乳腺上皮细胞分离纯化方法的不足，提供一种能在短期 内获得均一纯化的乳腺上皮细胞，且不会对细胞特异性功能造成影响的高效分离纯化乳腺 上皮细胞的方法。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供一种高效分离纯化乳腺上皮细胞的方法，包括 以下步骤：
[0006] 1)无菌手术采集动物乳腺实质组织，用含有青霉素、链霉素的Hank' s清洗液清 洗，剪碎成1_3以下的组织小块，置于上述清洗液中室温下震荡，如此反复直至溶液清亮， 收集组织小块备用；
[0007] 2)将步骤1)所得组织块放入胶原酶-透明质酸酶消化液中37°C震荡消化，200 目细胞筛过滤，收集滤取组织小块，接着用步骤1)中清洗液清洗组织小块3-5次，将清洗 后的组织小块置于细胞培养液中，接种到细胞瓶中培养，当瓶底细胞生长70 %以上时，用 0. 25%胰酶-0. 02% EDTA消化收集细胞，进行传代培养。
[0008] 在本发明优选的实施方案中，所述方法还包括采集动物乳腺实质组织后剔除血 管、结缔组织和脂肪组织的步骤。
[0009] 其中，所述Hank ' s清洗液中青霉素、链霉素的浓度分别为150_300U/mL和 150-300 μ g/mL〇
[0010] 其中，所述的细胞培养液为含5% -10% FBS的MEM、DMEM或DMEM/F12。
[0011] 其中，步骤2)中胶原酶-透明质酸酶消化液含200-300U/mL胶原酶I、100U/mL透 明质酸酶、l〇〇U/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素。
[0012] 优选的，步骤1)中乳腺组织取样于处在妊娠后期或泌乳期的成年哺乳动物。
[0013] 优选的，奶牛、牦牛和绵羊乳腺组织震荡消化的时间分别为2. 5-3h、3-3. 5h和 2~2. 5h〇
[0014] 优选的，步骤2)中消化后的细胞小块在细胞培养液中的密度为5-10块/ml。
[0015] 本发明较现有技术具有以下特点和优势：
[0016] 1、大大提高培养效率。传统植块法一般在第三天左右开始有成纤维样细胞长出， 第6-8天才有上皮样细胞长出，本发明方法在接种后第三天上皮样细胞就直接长出且几乎 不出现成纤维样细胞，大大缩短第一代培养时间，提高分离效率。
[0017] 2、本发明先用胶原酶消化适当时间，消化掉了腺泡外绝大部分以成纤维样细胞为 主的基质成分，剩余的主要是上皮细胞的腺泡组织，因此不需要反复的差速消化/差速贴 壁等复杂漫长的纯化方法去除成纤维样细胞，就可直接获得纯度均一的乳腺上皮细胞。
[0018] 3、实验操作简单易行，由于酶的消化作用，组织块更易贴壁生长，不需要传统植快 法中如培养瓶鼠尾胶原的处理、小块的摆放、组织块的粘附过程等的操作，只需将胶原酶消 化后组织小块按密度接种即可。
[0019] 4、本发明对细胞损伤小，分离细胞可在体外连续传代，且保留乳腺泌乳的特异性 功能。
[0020] 本发明方法先将组织小块消化适当时间再接种培养，国内外未见这种方法的报 道。本发明的技术难题在于酶量的选择、适当的消化时间以及合适的接种密度三者一个综 合的技术整体，适当的消化时间对于方法的成功尤为重要，整个方法需要长时间多次重复 试验才能最终确立。
[0021] 总之，本发明通过多次的试验探索和数据分析，创新的将酶消化法和组织块法合 二为一，新的方法既综合了以上两种方法的优点，又克服了需反复纯化的繁琐操作，大大提 高了乳腺上皮细胞的分离纯化效率。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合【具体实施方式】的实际操作步骤对本发明做进一步描述。但需说明的是， 本发明方法绝不局限于所举的实施例。
[0023] 实施例1奶牛乳腺上皮细胞的分离纯化
[0024] 1、乳腺组织的取样
[0025] 样品取自本地屠宰场一头成年泌乳期的黑白花奶牛，无菌手术剪开乳腺，在实质 部，避开血管、脂肪与结缔组织，采集8mm3大小组织块，75%酒精浸泡2~3s，在含200U/mL 青霉素和200 μ g/mL链霉素的Hank's液中清洗30s左右，置上述Hank's液中冰袋孵育带 回实验室。
[0026] 在超净工作台中修剪掉组织块可见的脂肪和结缔组织，用含150U/mL青霉素和 150 μ g/mL链霉素的Hank's液清洗2次，剪碎至1mm3以下大小，再加入30mL此Hank's液， 室温下震荡5min，弃去清洗液，如此反复，直至上清液清亮为止。收集10g左右组织小块备 用。
[0027] 2、最佳消化酶与消化时间的筛选
[0028] 1)、消化酶的筛选
[0029] 为了筛选合适的消化酶及酶的合适浓度，我们选取0. 05%胰酶-0. 02% EDTA、 0. 25 % 胰酶-0. 02 % EDTA、100U/mL 胶原酶 I -100U/mL 透明质酸酶、200U/mL 胶原酶 I -100U/mL透明质酸酶（四种消化液都含100U/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素）各15ml 消化不同时间后，200目细胞筛过滤，收集滤取组织小块进行培养，据培养后溢出成纤维细 胞团块的比例筛选消化酶，溢出成纤维细胞团块的比例越低，消化酶消化效果越好。结果如 表1 :
[0030] 表1 :不同消化液不同消化时间的消化培养结果
[0032] 从上表可以看出200U/mL胶原酶I -100U/mL透明质酸酶消化培养效果最佳，但 仍需纯化以去掉成纤维细胞，下步可以从胶原酶的浓度和消化时间上进一步筛选最佳的组 合。
[0033] 2)、最适消化时间的筛选
[0034] 为了确定最适合的消化时间和最佳的胶原酶浓度，选取200U/mL胶原酶I -100U/ mL透明质酸酶、250U/mL胶原酶I -100U/mL透明质酸酶、300U/mL胶原酶I -100U/mL透明 质酸酶各15ml (四种消化液都含100U/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素）消化不同时间后， 200目细胞筛过滤，收集滤取组织小块进行培养，据培养后溢出成纤维细胞团块的比例筛选 消化酶，溢出成纤维细胞团块的比例越低，消化酶消化效果越好。结果如表2 :
[0035] 表2 :不同胶原酶浓度不同消化时间的消化培养结果
[0036]
[0037] 从上表可以看出250U/mL和300U/mL的胶原酶浓度消化2. 5-3h都可以得到较好 的结果。虽有极低比例的组织块周边有极少成纤维细胞溢出，但原代消化后得到乳腺上皮 细胞纯度达98%以上，满足细胞纯化的要求，同时，原代传代时可挑选没有成纤维细胞溢出 的传代。综合考虑效率、成本，实施例1选取250U/mL胶原酶I -100U/mL透明质酸酶，室温 消化3h为奶牛乳腺组织的最佳消化组合。
[0038] 3、最适接种密度的筛选
[0039] 将最佳消化酶与消化时间筛选实验中，250U/mL胶原酶I -100U/mL透明质酸酶， 室温震荡消化3h，200目细胞筛过滤所得的细胞团块分别按1-5、5-10、10-15块/ml的密度 接种培养，据培养效果筛选最适的接种密度。结果见表3 :
[0040] 表3 :消化后组织块不同接种密度培养结果
[0042] 从上表看出5-10块/ml的接种密度，5-6d就可生长70%以上，从而传代培养，有 效的缩短了原代培养的时间，为最佳接种密度。
[0043] 实施例2绵羊乳腺上皮细胞的分离纯化培养
[0044] 样品取自一头成年妊娠后期绵羊，无菌剪开乳腺，在实质部，避开脂肪和结缔组 织，采集8mm3大小组织块，75 %酒精浸泡2~3s，在含200U/mL青霉素和200 μ g/mL链霉素 的Hank's液中清洗30s左