一株凝结芽孢杆菌及其在动物消化道中后肠段模拟装置中厌氧代谢、产乳酸的快捷鉴定的制作方法
【专利摘要】一株凝结芽孢杆菌及其在动物消化道中后肠段模拟装置中厌氧代谢、产乳酸的快捷定性、定量鉴定法，属于微生物应用【技术领域】。一株凝结芽孢杆菌，其分类名为：凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans）PFK1102A，该菌是革兰氏阳性杆菌，端生芽孢，菌落边缘整齐，兼性厌氧或者好氧，最适生长温度37～45℃，最适pH为5.5～7.5。该菌能在有氧条件下产芽孢，也能在发酵过程中代谢乳酸；还在类似动物消化道中后肠段装置中厌氧代谢、产乳酸。一种模拟动物消化道中后肠厌氧环境的装置，由密封塞、液体石蜡层、培养基和玻璃瓶4部分组成，可用于微生态制剂菌种的鉴定及微生物在动物消化道中后肠段厌氧代谢、产乳酸的鉴定。
【专利说明】一株凝结芽孢杆菌及其在动物消化道中后肠段模拟装置中厌氧代谢、产乳酸的快捷鉴定
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物应用【技术领域】，涉及一种能在体外环境下模拟动物消化道中后肠段厌氧环境的并用于微生态制剂菌株鉴定的简易装置，特别是涉及一种凝结芽孢杆菌在动物消化道中后肠段模拟装置中厌氧代谢、产乳酸的快捷筛选和鉴定的定性、定量方法。
【背景技术】
[0002]微生态制剂领域中的活菌制剂类饲料添加剂，具有调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡、促进生长和提高机体免疫力等作用，且能够减少服用抗生素带来的耐药性、二重感染及药物残留等问题，已被广泛地应用于畜牧及水产养殖业。活菌制剂类饲料添加剂所涉及的微生物菌株种类繁多，包括各种芽孢杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌、屎链球菌、双歧杆菌、酵母菌等；但作为一种饲料添加剂，首先必须对高温制粒等饲料加工工艺有足够的抵抗力，而各类有益微生物菌株中只有芽孢杆菌的芽孢制剂才具备此能力，所以，多年来真正得到广泛应用的活菌制剂类饲料添加剂是枯草、地衣、蜡样等芽孢杆菌(包海泉，2004 ;付殿国和徐明，2005 ;庄俊峰等，2006 ;曹晓敏，2009)。
[0003]菌株的筛选和活性的测定是活菌制剂类饲料添加剂研究、开发中的关键问题之一，决定微生态制剂的使用效果。此领域目前研究工作的现状是围绕着菌株是否能耐胃酸、 耐高胆盐、耐抗生素(赵新海，2003 ;闵钟熳，2007 ;曹晓敏，2009)，是否具有对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有害微生物的抑菌圈(闵钟熳，2007 ;曹晓敏，2009)，是否可以发酵产酶(龙燕，2007 ;曹晓敏，2009 ;罗碧毅等，2009)等方面展开。虽然这些筛选菌株的指标是一株优秀的微生态制剂菌株所必备的，但有一个前提条件无人问津，那就是菌株在动物消化道发挥主要作用的“中后肠段”之厌氧环境中能否进行正常的生理代谢。一株再好的菌株如果不能够在动物肠道中后段的厌氧环境中进行正常代谢活动，那么此菌株又怎能去抑制有害菌？怎能产酶去促进消化？怎能去发挥提高免疫力等等益生作用？另一方面，可在动物消化道中后肠段厌氧代谢的益生菌，最好且为行业所公认的代谢产物之一是乳酸等。所以，活菌制剂类饲料添加剂在抗逆性强这一先决条件的基础上，若要发挥除“微生物夺氧”以外更多的益生作用而实现使用效果得到大幅度提高的产业升级目的，其前提之一是筛选出能够在动物消化道中后肠段拥有可厌氧代谢、产乳酸等特征的有益微生物菌株。为此，需要一套能够模拟动物肠道中后段无氧环境的简便装置，并借此进行益生菌株的厌氧代谢、产乳酸等定性、定量的筛选和鉴定工作。
凝结芽孢杆菌在我国是一种相对新`兴的活菌制剂类饲料添加剂可使用菌株，它既具备乳酸杆菌耐酸、厌氧代谢、产乳酸的一切优良特征，又具备芽孢杆菌耐高温、耐酸等特征。凝结芽孢杆菌可以以芽孢形式顺利克服饲料制粒的高温破坏并通过胃酸环境，进入到肠道后会进行肠道繁殖消耗游离氧，还可以厌氧代谢产乳酸而直接抑制有害菌等，较之不产酸的芽孢杆菌更益于恢复肠道微生态平衡。凝结芽孢杆菌还能通过对动物消化道菌群和体内消化酶的影响，提高动物自身对体内营养物质的消化吸收能力。因此它有望成为活菌制剂类饲料添加剂领域的产业升级菌株，代表了一种发展方向。
[0004]本发明提供一株凝结芽孢杆菌，同时提供一种模拟动物肠道中后肠段厌氧环境的简易装置，建立一个微生态制剂在动物消化道中后肠段厌氧代谢产物的快捷鉴定方法，并建立一套完整的用于口服微生态制剂菌种筛选和鉴定的定性、定量方法，旨在提高微生态制剂菌种筛选的效率，提高微生态制剂的可实用性，为动物微生态制剂产业升级奠定基础。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种模拟动物中后肠段厌氧环境的简易装置。
简易装置如图1所示，由4部分组成:I密封塞，2液体石蜡密封层，3培养基，4玻璃瓶。 此装置可有效提供厌氧环境，具体操作如下:密封塞是用硅胶塞和封口膜组成，液体石蜡为无菌液体，培养基为MRS培养基加入0.1~0.2% (w/V)的硫代乙醇酸钠(HSCH2C00Na)和少量美蓝指示剂的混合液，玻璃瓶为医用点滴瓶。硫代乙醇酸钠是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原性物质，提供厌氧环境。培养基中加入少量美蓝液作为氧化还原的指示剂，在无氧条件下，美蓝被还原成无色；反之，培养基呈蓝色说明有氧气存在。
本发明与现有技术相比存在以下优点:
1、提供了一种简易装置模拟动物消化道中后肠段厌氧环境，本发明成本低廉，操作简单。
2、本发明是模拟微生物在动物消化道中后肠段的生长代谢活动，可有效检测微生物在厌氧环境中的代谢产物。
[0006]本发明还提供一株能够在厌氧条件下发酵葡萄糖生产乳酸的凝结芽孢杆菌。
[0007]本发明提供的凝结芽孢杆菌菌株(Bacillus coagulans)的名称为PFK1102A。
[0008]本发明提供的凝结芽孢杆菌菌株(Bacillus coagulans)于2012年4月24日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址位于北京市朝阳区北辰西路I 号院3号，保藏编号为:CGMCC NO 6047。
凝结芽孢杆菌PFKl 102A是一株革兰氏阳性杆菌，端生芽孢，在YPD和MRS培养基上生长良好，48 hr形成直径2~3mm大小的圆形菌落，菌落呈白色有光泽，边缘整齐；好氧或兼性厌氧，最适生长温度37~45°C,最适pH为5.5~7.5。
[0009]【专利附图】
【附图说明】
图1是简易装置的示意图。其中I密封塞，2液体石蜡，3玻璃瓶，4培养基。
图2是凝结芽孢杆菌PFKl 102A在简易装置中的生长曲线。
[0010]【具体实施方式】
[0011]实施例1、简易装置的设计
(I)简易装置的设计
[0012]如图1所示，此简易装置由4部分组成:1密封塞，2液体石蜡密封层，3玻璃瓶，4 培养基。密封塞采用硅胶塞加封口膜密封，液体石蜡为无菌液体，培养基为MRS培养基加入
0.1~0.2% (w/V)的硫代乙醇酸钠和少量美蓝指示剂的混合液，玻璃瓶为医用点滴瓶。
培养基和液体石蜡分别在115 °C高温下灭菌20 min，冷却待用；接种时，先用无菌吸管按3~5%的接种量接种种子液，在加入无菌液体石蜡液封，最后用密封塞密封，置于恒温培养箱中静止培养。[0013](2)厌氧条件的发生
硫代乙醇酸钠(HSCH2C00Na)是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原性物质，提供厌氧环境。培养基中加入少量美蓝液作为氧化还原的指示剂，在无氧条件下，美蓝被还原成无色；反之，培养基呈蓝色说明有氧气存在。
在MRS培养基中加入0.1 %的硫代乙醇酸钠，再加入少量美蓝作为指示剂，115 °C灭菌 20 min待用。
[0014]实施例2、菌种的筛选与分离
在湖南长沙某屠宰场采取猪肠道粪便样品。将样品制成悬浮液，37 °C经富集培养24 hr后，置于80 °C水浴中加热15 min，杀死不形成芽孢的菌体。摇匀后稀释涂平板，并利用芽孢生长培养基进行划线法分离纯化，根据菌落大小选取生长良好的菌落反复接种筛选， 直至得到均匀单个菌落，命名为PFKl 102A。
[0015]实施例3、菌株PKF1102A在简易厌氧装置中的培养
斜面种子培养:取一环菌泥划线于营养肉汁琼脂培养基上，于42°C下培养24 hr ； 种子摇瓶培养:取一环斜面接种装有25 ml MRS培养基的250 ml三角瓶中，42 °C, 150 r/min培养24 hr，成为一级种子液；
[0016]摇瓶发酵培养:以5%接种量将一级种子液接入装有100 ml MRS培养液的500 ml 三角瓶中，42°C，200 r/min培养24 hr，成为二级种子；
[0017]厌氧发酵培 养:将二级种子以3~5%的接种量接入装有200 ml发酵培养基的简易厌氧装置中，接种后，加入适量灭菌的液体石蜡密封，杜绝空气与培养基接触。用密封塞将培养瓶的瓶口密封后，将装置置于42 °C培养箱中静止培养，定时取样测定其0D600，结果如图2所示，静止培养24 hr后，菌株PFK1102A有明显的生长现象，静止培养168 hr后 0D600超过1，菌株PFK1102A能够在动物消化道中后肠厌氧环境中生长。
本实施中涉及到培养基的构成是:
[0018]营养肉汁琼脂培养基:蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂粉15.0 g,水 1.0 L, pH 7.0 ；
[0019]MRS培养基:蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，吐温80 I ml，柠檬酸二胺 2.0 g, K2HP04 2.0 g,葡萄糖 20.0 g,乙酸钠 5.0 g, MgS04 ? 7H20 0.1 g, MnS04
0.05 g，水 1.0 L, pH 7.0 ；
厌氧发酵培养基=MRS培养基加入0.1~0.2%的硫代乙醇酸钠和少量美蓝指示剂，pH
7.0。
实施例4、菌种鉴定
[0020](I)形态特征
在YPD和MRS培养基上生长良好，培养48 hr后形成直径2_3mm大小的圆形菌落，菌落呈白色有光泽，边缘整齐，不透明；显微镜下菌株细胞呈直杆状，芽孢端生。
[0021](2)生化特征
菌株PFK1102A革兰氏染色阳性，不能分解淀粉、乳糖，能分解葡萄糖产酸不产气。
[0022](3) 16S rRNA 序列分析
对分离得到的菌株PFK1102A进行进一步的16S rRNA序列分析与对比。鉴定采用通用性引物 27F 和 1492R。引物序列如下，27F:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3 '和 1492R:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由上海英俊合成。以筛选得到的菌株的总DNA为模板进行PCR扩增，扩增条件:95 °C预变性5 min, 94 °C变性45 sec, 49 °C退火45 sec, 72 V 延伸90 sec，反应30循环。目的片段按照常规方法进行测序，测定结果提交到GenBank中进行序列比对分析，基因同源性达到99.4%以上。根据《Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology》(Holt, J.G.Gibbons, N.E., 1"4)和《常用细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英等，2001)，通过形态特征、生化特征和16S rRNA基因序列分析，确定菌株 PFKl 102A为凝结芽孢杆菌。该菌株进行保藏于。
[0023](4)培养特征
菌株1102A适宜的生长温度范围为37~45 °C，最适pH范围为5.5~7.5，兼性厌氧或者好氧。
实施例5、发酵液中乳酸的检测
按实施例3中对菌株PFKl 102A进行培养，培养24 hr后对厌氧发酵产物进行检测。[0024](I)乳酸的定性检测
取发酵液上清10 ml于试管中，加入10% H2S04 1.0 ml，再加2% KMn04 1.0 ml，混匀， 把事先在含氨的硝酸溶液中浸泡的滤纸条搭在试管口上，微火加热试管至沸。滤纸变黑，说明有乳酸存在，并可以闻到乙醛的特殊气味。培养24 hr后用，培养基的pH由最初的7.0 下降到5.3。
[0025](2)乳酸的定量检测
吸取一定量培养24 hr后的发酵液高速离心后，精确吸取上清20 ml，加入2.0 ml盐酸溶液(1+4)定容至50 ml，再加5 ml氢氧化钠溶液(100 g/L)和0.1 g钙紫红素指示剂， 用0.05 mo I/L EDTA标准滴定溶液滴至蓝色为终点。滴定到终点时，总共消耗掉EDTA标准液1.8 ml，计算得到发酵液中乳酸的含量为3.3 mg/ml。
【权利要求】
1.一株凝结芽抱杆菌(Bacillus coagulans) PFK1102A。
2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans) PFK1102A,其特征在于:所述的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) PFKl 102A是革兰氏阳性杆菌,端生芽孢， 在YPD和MRS培养基上生长良好，48 hr形成直径2~3mm大小的圆形菌落，菌落呈白色有光泽，边缘整齐；兼性厌氧或者好氧，最适生长温度37~45°C，最适pH为5.5~7.5，其16S rRNA基因的核苷酸序列如Seq.1102A所示。
3.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)PFKl 102A是一株能厌氧代谢葡萄糖产乳酸的菌株。
4.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)PFKl 102A生长所需的氧化还原电势比较宽泛。
5.一种模拟动物中后肠段厌氧环境的简易厌氧装置，此厌简易厌氧装置及其功能以及在此基础上的简单改造均属于保护范围。
6.根据权利要求5所述的简易厌氧装置可用于微生态制剂菌种的筛选。
7.根据权利要求5所提供的简易厌氧装置可实现微生物在厌氧条件下代谢产物的定性、定量的快捷鉴定。
【文档编号】C12Q1/04GK103589654SQ201210287843
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月14日 优先权日:2012年8月14日
【发明者】罗国升, 刘亚力, 张煌 申请人:湖南普菲克生物科技有限公司