甲基?β?环糊精在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用
【专利摘要】甲基?β?环糊精在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用，用含有一定浓度MβCD处理BmNPV非宿主细胞后，能显著的提高BmNPV感染非宿主昆虫细胞效率，使BmNPV可在非宿主细胞中复制扩增，产生有感染性的病毒粒子及多角体，而对照细胞BmNPV则完全不能复制，更观察不到多角体的产生。本发明解决了BmNPV宿主域狭窄的问题，能使BmNPV在非宿主细胞复制，高效感染非宿主细胞，产生多角体。同时也可改善杆状病毒作为生物杀虫剂宿主范围窄，杀虫速度慢等缺点，还可促进昆虫杆状病毒与宿主细胞相互作用、杆状病毒受体以及杆状病毒入侵宿主的机制等研究的发展。
【专利说明】
甲基-β-环糊精在扩大家香核型多角体病毒宿主域中的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物杀虫剂与杆状病毒学领域，涉及甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin，简称MKD，也有表示为MBCD，Me-KD，MeBCD)在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用。
【背景技术】
[0002]杆状病毒是已知昆虫病毒中的最大类群，是发现最早、研究最多的且实用意义很大的昆虫病毒，是一种闭合环状双链DNA的囊膜病毒，基因组大小约为80?180kb。由于杆状病毒又是农林业主要害虫的控制因子，因此也被广泛应用于生物杀虫剂。
[0003]杆状病毒绝大部分是从昆虫中分尚得来的，都具有相对狭窄的宿主域。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus AcMNPV)和家香核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)是研究的最为广泛的两种昆虫杆状病毒，虽然两个病毒基因组有很高的同源性，但是AcMNPV的宿主域比BmNPV宽得多，AcMNPV可在sf9、sf21、TN-368、CLS-79细胞系复制，但不能在家蚕BmN细胞中复制，而BmNPV则不同于AcMNPV，仅在BmN、Bm5等细胞系内复制，对非宿主细胞sf 9、sf 21、TN_368等几乎不能感染(吕鸿声.昆虫病毒分子生物学[M].北京:中国农业科学出版社，1998，pl70-174.)。
[0004]目前已有很多利用分子生物学和基因工程手段改造杆状病毒基因组，扩大杆状病毒宿主域的报道(郭睿等，可感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建，中国农业科学，2012，45 (16): 3288-3296)，但是利用Μβ⑶扩大杆状病毒宿主域方面还未见相关报道。
[0005]家蚕是我国重要的经济昆虫，而BmNPV引起的脓病是蚕桑生产中最严重的病害，BmNPV传染性很强，但是由于连续养蚕，导致病毒杀灭不完全，每年由于BmNPV感染导致脓病的发生给蚕丝业带来的巨大损失高达蚕桑生产总值16%。家蚕在幼虫期体长和体重迅速增加，到5龄期，体重每头可达5-7克，由于家蚕体积大，当BmNPV爆发性发生时可以产生大量的BmNPV病毒，目前生产中这些病毒必须经过严格的消杀处理，以避免病毒再次传播。但是如果可以把这种养蚕业避免不了的危害物加以利用，就可以变废为宝。
【发明内容】
[0006]解决的技术问题:本发明提供一种甲基-β_环糊精在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用，
【申请人】前期研究发现当MKD浓度较高时，MKD可以完全抑制BmNPV入侵家蚕BmN细胞，但当浓度较低时，它却可以增强BmNPV入侵非宿主细胞，比如sf9和sf21。即用含有一定浓度邸⑶的细胞培养液孵育BmNPV的非宿主昆虫细胞后，再用BmNPV感染处理的细胞，即可显著提高BmNPV对非宿主昆虫细胞的感染效率，该方法简单明了，便于操作，成本低廉，易于推广，提尚效率显者。
[0007]技术方案:甲基-β_环糊精在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用。
[0008]所述甲基-β-环糊精的工作浓度为0.125-2mM。
[0009]所述宿主为8€9、8€21、11丨811f ive(Hi5)、ΤΝ369、ΗζΑΜ1。
[0010]扩大家蚕核型多角体病毒宿主域的组合物，有效成分包括甲基-β-环糊精。
[0011]1.Μβ⑶(购自Sigma公司)溶液的配置及病毒准备
[0012]用IXPBS[购自生工生物工程(上海)股份有限公司]溶解聽⑶，配制浓度为50mM的储存液。
[0013]BmBacJS13 是一株与 BmNP V具有相同感染特性的 Bacm i d [ Huang JS e ta 1.Construct1n of the Bac — to—Bac System of Bombyx moriNucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3):218-225]。为了便于观察及统计本发明所述的感染效率，将hsp70操纵下的报告基因egf p及BmNPV的多角体基因(口01}^(1瓜40111)同时转座到&111^1(^313的1'117转座插入位点，重组后的匕30111(1命名&111^1(3-egfp-ph，提取重组bacmid的DNA，转染家蚕细胞，荧光显微镜下观察到强烈的绿色荧光，收获出芽病毒(Budded Virus，BV)后，继续用于感染家蚕细胞进行病毒扩增，72h后收获病毒，利用终点稀释法测定病毒滴度，4°C避光保存，用于本发明所有方法中。
[0014]2.不同浓度Μβ⑶孵育细胞及随后病毒感染的细胞荧光观察
[0015]分别在细胞培养皿中接种正常培养的BmNPV非宿主昆虫细胞，例如sf9、sf21等，贝占壁24h后，用配制好的Μβ⑶储存液加入到细胞培养基中，使聽⑶终浓度分别为0.125-2mM，孵育20-60min，孵育细胞温度为24-29°C，以OmM MKD(即等体积I XPBS)作为对照。孵育时间到后，分别去除I XI3BS和不同浓度的MKD孵育液，用无血清的TC-100培养基或其它昆虫细胞培养基轻轻冲洗细胞2次(也可不洗)，接着用MOI = 5-50携带绿色荧光蛋白基因的BmBac-egfp-ph病毒分别感染不同处理的细胞，27°C感染Ih后，用无血清昆虫细胞培养基轻洗2遍(也可不洗)，放置于27°C培养箱培养，培养后6-72h，即在荧光显微镜下可观察到不同处理表达荧光细胞数量的差异。在感染后期，用MPCD孵育过的细胞在光学显微镜下能看见病毒多角体的形成，而对照I ><?83孵育的细胞无多角体的形成。图1是&1^&0-68办-?11感染非宿主昆虫细胞sf21示例的结果，当用I XPBS对照孵育sf21细胞时，病毒感染效率非常低，感染后72h没有多角体的形成，但用0.25mM的MPCD处理后，感染效率显著提高，感染72h后细胞全部都有绿色荧光表达，表明BmNPV在sf21细胞中可以很好的复制，而且能看见多角体的形成(红色箭头所示)。
[0016]3.不同浓度Μβ⑶孵育细胞对BmBac-egfp-ph感染率影响
[0017]分别在24孔细胞培养板中接种正常培养的BmNPV非宿主昆虫细胞，贴壁24h后，用配制好的MPCD储存液加入到细胞培养液中，使MPCD终浓度分别为0.12 5?2mM，孵育2 O -60min，孵育细胞温度为24-29°C，以OmM MKD(即等体积I XPBS)孵育液作为对照。孵育时间到后，分别去除I XPBS和不同浓度的MKD孵育液，用无血清昆虫细胞培养基或者PBS轻轻冲洗细胞2次，接着用皿)1 = 10携带绿色荧光蛋白基因的&^&(:-叫€?-?11病毒分别感染不同处理的细胞，27°C感染Ih后，去除未吸附的病毒粒子及培养基，用无血清的昆虫细胞培养基或者I3BS轻洗2遍，加入正常细胞培养基，放置于27 °C培养箱培养6h后，去除细胞培养基，用PBS悬浮细胞，用流式细胞仪统计有荧光表达的细胞数，利用t测验分析不同浓度MKD孵育细胞与对照的在病毒感效率方面的差异。实验设三个重复。统计结果显示0.125mM MKD处理细胞时，BmNPV感染的细胞效率约为对照2.5倍，而0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM Μβ⑶处理后的感染效率分别为对照5.5、5.6、6、6.3、6.7、5.9倍。
[0018]4.BmNPV在Μβ⑶孵育后的细胞中病毒生长曲线测定
[0019]分别在6孔细胞培养板中接种正常培养的BmNPV非宿主昆虫细胞，贴壁后，用配制好的MKD储存液加入到细胞培养液中，使Mf3CD终浓度为0.25mM，27°C孵育30min，以OmM Μβ⑶(即等体积I X roS)孵育液作为对照。孵育时间到后，分别去除I XI3BS和不同浓度的MKD孵育液，用无血清的昆虫细胞培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用M0I = 20BmBaC-egfp-ph BV病毒分别感染不同处理的细胞，27°C感染2h后去掉病毒感染液，用无血清的昆虫细胞培养基轻洗2遍(以此时间设定为Oh)，加入2mL正常培养基27°C常规培养，分别在感染后0、12、24、48、7 2、96h取上清样品I OyL，利用BmN细胞，采用终点稀释法测定每个时间点的病毒滴度，实验设三次重复，绘制病毒的一步生长曲线，以确定BmNPV病毒在sf21细胞中是否可以正常复制扩增。图3是Μβ⑶终浓度为0.25mM和对照I3BS的病毒一步生长曲线，从图中可以发现，BmNPV感染sf 21后，对照在0_96h的生长曲线为一条直线，细胞没有产生病毒粒子，表明BmNPV在未处理的非宿主细胞sf21不能复制，而MKD处理细胞后，在O与12h时间点没有病毒粒子产生，但后期病毒粒子数量开始上升，并一直持续到感染后96h，表明BmNPV感染后病毒能在非宿主细胞中复制，并产生具有感染性的病毒粒子。
[0020]有益效果:本发明首次发现MKD的一种新用途。用含有一定浓度Μβ⑶培养基处理BmNPV非宿主细胞后，能显著的提高BmNPV感染非宿主昆虫细胞效率，使BmNPV可在非敏感细胞中复制扩增，产生有感染性的病毒粒子及多角体，而对照细胞BmNPV则完全不能复制，更观察不到多角体的产生。该用途的发明，解决了BmNPV宿主域狭窄的问题，能使BmNPV在非宿主细胞复制，高效感染非宿主细胞，产生多角体。同时也可改善杆状病毒作为生物杀虫剂宿主范围窄，杀虫速度慢等缺点，还可促进昆虫杆状病毒与宿主细胞相互作用、杆状病毒受体以及杆状病毒入侵宿主的机制等研究的发展。本发明提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。
【附图说明】
[0021]图1为利用本发明中所述方法终浓度为0.25mM Μβ⑶处理sf21细胞(对照用I3BS处理)，病毒BmBac-egfp-ph感染72h后焚光及可见光比较图:
[0022]A与B为BmBac-egfp-ph感染PBS处理细胞的荧光图片及可见光图片;C与D为BmBac-egfp-ph感染MPCD处理后细胞的荧光图片及可见光图片;D中箭头所示为BmNPV多角体。放大倍数为640 X。结果显示对照细胞荧光数量非常少，而处理后的细胞几乎所有细胞均被感染，而且MPCD孵育过的细胞能观察到多角体，对照处理则观察不到多角体。
[0023]图2为利用本发明中所述方法七种不同浓度Μβ⑶处理和对照I3BS处理sf21细胞后BmNPV感染效率比较:
[0024]BmNPV对照为BmBac-egfp-ph入侵未经MKD处理的sf21细胞感染效率，AcMNPV对照为苜蓿银纹核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)对8€21的感染效率(101 = 1)，**表示各卵00处理组与8111邪￥对照具有显著性差异(？〈ο.οοι)ο
[0025]图中数据为三次重复结果。不同浓度Μβ⑶处理后，细胞感染率显著大于对照，并且和AcMNPV达到相近的感染效果(Μ0Ι = I)，sf21为AcMNPV宿主细胞)。
[0026]图3为利用本发明中所述方法0.25mM MKD处理和对照PBS处理sf21，BmBac_egfp-ph在sf21细胞中病毒生长曲线比较:
[0027]纵坐标为病毒半数组织感染剂量(TCID5Q)LOg1O对数，横坐标为感染后时间点。对照PBS处理细胞中没有感染性的病毒粒子释放，病毒生长曲线为一条直线，表明BmBac-egfp-ph 在对照中没有复制扩增 ，而MKD 处理细胞在 12h 后开始释放出有感染性的病毒粒子，并一直持续到感染后96h，表明BmNPV在聽⑶处理后细胞中可以有效复制、扩增。
【具体实施方式】
[0028]以BmNPV感染非宿主昆虫细胞sf21为例，说明本发明的具体实施步骤:
[0029]Μβ⑶(购自Sigma公司)溶液的配置及病毒准备
[0030]用IXPBS[购自生工生物工程(上海)股份有限公司]溶解聽⑶，配制浓度为50mM的储存液。
[0031 ] BmBacJS13 是一株与 BmNP V具有相同感染特性的 Bacm i d [ Huang JS e ta 1.Construct1n of the Bac — to—Bac System of Bombyx moriNucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3):218-225]。为了便于观察及统计本发明所述的感染效率，将hsp70操纵下的报告基因egfp及多角体基因转座到BmBacJS13的Tn7转座插入位点，命名BmBac-egfp-ph，提取DNA，转染家蚕细胞，收获出芽病毒后，继续用于感染家蚕细胞，荧光显微镜下观察到强烈的绿色荧光，72h后收获病毒，终点稀释法测定病毒滴度，4 °C避光保存，用于以下本发明所述方法中。
[0032]实施例1:终浓度为0.25mM Mf3CD孵育，对BmNPV感染非宿主细胞效率的提高
[0033]分别在两个35mm细胞培养皿中各接种约5X 15个/皿的sf21细胞，贴壁后，取配制好的Μβ⑶储存液加入到其中一个皿细胞培养液中，使MKD终浓度分别为0.25mM，以OmM Μβ⑶(即相应体积I X PBS)孵育液加入另外一个皿作为对照，27°C孵育30min，然后分别去除IXI3BS和MKD孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用MOI = 10携带绿色荧光蛋白基因和多角体基因的BmBac-egfp-ph病毒分别感染不同处理的细胞，27°C感染2h后，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，加入含10%胎牛血清的常规的TC-100培养基，放置于27°C培养箱培养72h后，荧光显微镜观察病毒感染效率的变化。如图1所示，当用PBS处理细胞时，病毒感染后仅有极少数细胞有绿色荧光蛋白的表达，但是当用MKD处理后，几乎所有细胞均被病毒感染，有绿色荧光蛋白的表达，而且能看见多角体的形成，表明本发明方法可以很好的提高BmNPV对非宿主细胞的感染效率。
[0034]实施例2:分别用终浓度为0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM的MKD处理后，流式细胞仪统计病毒感染效率的变化
[0035]在24孔细胞培养板中各接种约I X 15个/孔的sf21，贴壁24h，分别取配制好的ΜβCD储存液1.25yL、2.5yL、5yL、7.5yL、10yL、15yL、20yL加入到细胞培养液中(细胞培养液总体积为500yL/孔)，使聽⑶终浓度分别为0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM，在BmNPV对照及AcMNPV对照中加入20yL I XPBS，27°C孵育30min后去除I X PBS和不同浓度的MKD孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用MOI = 1携带绿色荧光蛋白基因和多角体基因的 BmBac-egfp-ph 病毒分别感染 0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mMM0CD孵育和 PBS孵育的细胞，并用MOI = I的AcMNPV感染PBS孵育细胞作对照，27°C感染Ih后，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，放置于27 °C培养箱培养6h后，去除细胞培养基，PBS悬浮细胞，流式细胞仪统计有荧光表达的细胞数，确定不同浓度Mi3CD孵育细胞后，BmNPV感染非宿主细胞的效率。图2是BmNPV感染非宿主昆虫细胞sf21示例的结果，统计显示0.125mM Μβ⑶处理细胞时，BmNPV感染的细胞效率约为对照2.5倍，而0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM Μβ⑶处理后的感染效率分别为对照5.5、5.6、6、6.3、6.7、5.9倍，达到极显著水平(？〈0.001)。
[0036]实施例3:M0CD终浓度为0.25mM时，BmNPV感染后病毒生长曲线测定
[0037]分别在6孔细胞培养板中接种约5X 15个/孔sf21细胞，贴壁后，取配制好的邸⑶储存液1yL加入到贴壁细胞sf21的细胞培养液中，使MKD终浓度分别为0.25mM(总体积为2mL)，27°C孵育30min，以1yLl XPBS孵育液作为对照。孵育时间到后，分别去除I XPBS和Μβ⑶孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用MOI = 20携带绿色荧光蛋白基因和多角体基因的BmBac-egfp-ph病毒分别感染不同处理的细胞，27°C感染Ih后，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，加入正常细胞培养液2mL(以此时间设定为Oh)，27°C正常培养，分别在感染后0、12、24、48、72、96h收集1yL上清病毒，利用BmN细胞通过终点稀释法测定每个时间点病毒的滴度，感染及滴度测定设三次重复。根据不同时间点的病毒滴度，绘制病毒的一步生长曲线。图3结果表明，对照I3BS处理细胞后，BmNPV感染后，在0-96h病毒没有感染性病毒粒子产生，而BmNPV感染Mf3CD处理细胞后，从12h开始释放出有感染性病毒粒子，一直持续到感染后96h，表明BmNPV病毒在Mf3CD处理细胞中可以复制、扩增，产生有感染性病毒粒子。
[0038]最后应当说明的是:以上所述的实施例和实施方式所述的MKD浓度和处理时间仅用于说明性目的而非限制，但本领域的普通技术人员应当理解，在细胞状态或者细胞培养基理化性质等(比如酸碱度等)微小的差异，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围，同时也包含其它家蚕核型多角体病毒非宿主细胞，诸如sf9、high five(Hi5)、TN369、HZAMl等非家蚕昆虫细胞和悬浮培养的上述细胞，并被包括在本申请的精神和范围之内。
【主权项】
1.甲基-β-环糊精在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述甲基-β_环糊精的工作浓度为0.125-2mM。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述宿主细胞为sf9、sf 21、high five(Hi5)、TN369、HzAMl。4.扩大家蚕核型多角体病毒宿主域的组合物，其特征在于有效成分包括甲基-β-环糊相ο
【文档编号】C12N7/00GK106047822SQ201610384217
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】郝碧芳, 黄金山, 柳林, 南文斌, 沈兴家
【申请人】江苏科技大学