外部志贺菌蛋白f(ospf)的治疗用途的制作方法

专利名称：外部志贺菌蛋白f(ospf)的治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及多种新一类的双特异性磷酸酶、使用所述磷酸酶治疗疾病 的方法、鉴定调变所述磷酸酶的活性的药剂的方法、鉴定模拟所述磷酸酶 的活性的药剂的方法、调节免疫应答的方法、和包含所述磷酸酶的免疫原 性组合物。本发明还涉及含有灭活的0^F基因的弗氏志贺菌(57z/ge//fl y e;c^n〕菌株、以及包含含有灭活的wpF基因的弗氏志贺菌菌株的疫苗。
背景技术：
弗氏志贺菌是革兰氏阴性病原菌，其通过感染人的结肠上皮细胞而引 起杆菌性痢疾。志贺菌主要感染肠道上皮细胞(IEC) (Jung et al., 1995)。志 贺菌表达数种蛋白质，这些蛋白质提供一种递送效应物的机制，所述效应 物诱导细菌通过吞噬作用被摄入宿主细胞。这些蛋白质形成III型分泌系 统(TTSS)，并由一220-kb的侵袭性质粒(virulence plasmid)编码。然后， 志贺菌通过裂解吞噬泡而得以进入胞浆，而后表达运动表型，以便能够感 染附近的其他细胞。
为了成功实现感染，志贺菌必须精细调节宿主的免疫应答，特别是那 些导致炎症的应答。不同于鼠伤寒沙门菌(5Wmo"e〃a 0^"'附腊'MW)的是， 志贺菌不能有效侵入极化正C的顶极，而是需要多形核白细胞(PMN)的移 行才能突破上皮细胞屏障，通过上皮细胞的基底外侧极促进侵入细胞 (Perdomo et al.， 1994)。由天然免疫系统的细胞促进的宿主炎性应答将PMN 吸引至炎症部位。因此，在感染的早期引发炎症对于志贺菌侵入细胞是必 需的。到达正C的细胞内部分的细菌抗生长并从细胞至细胞进行传播，从 而躲避宿主的免疫防御。但被感染的IEC在炎症过程中发挥很大的作用， 既是侦査细菌侵入的哨兵，又是介质的主要来源，特别是那些介导炎症应答的细胞因子和趋化因子的主要来源。这些介质包括那些触发粘膜炎症并
使之全面发作的细胞因子和趋化因子(Jung et al.， 1995)。正C主要是在细胞 内通过胞浆分子Nodl/CARD4对细菌加以识别，Nodl/CARD4能够发现一 种微生物基序，即肽聚糖(Girardin et al.， 2003)。 Nodl的活化诱导其他促 炎信号途径，包括NF-kB和oJun N-端激酶(JNK)，导致表达趋化因子 (Philpotteta1.，2000)，例如白细胞介素-8 (IL-8)。这些趋化因子对于清除病 原体至关重要(Sansonetti et al.， 1999)。因此，引发过度的炎症可危及志贺 菌在宿主中的存活。为了存活，此类细菌已经进化出用于调变促炎基因转 录的策略。
尽管植物和动物病原体已经产生了多种抑制免疫力的策略，但通过 TTSS的效应分子移位仍是许多细菌病原体控制宿主天然免疫应答的机 制。已经发现志贺菌的III型分泌型OspG分子通过阻断IkB-cx的遍在蛋白 化而拮抗lKB-a的降解，表明该微生物具有调节炎症应答的能力(Kim et al., 2005)。来自假结核耶尔森氏菌(7erw'"/"fl /weWo/wZ)e/"cw/a^)的TTSS效应 物如YopE、 T和H主要针对肌动蛋白聚合作用而逃脱吞噬作用(Comelis, 2002)，而其他TTSS效应物抑制由天然免疫应答介导的促炎防御应答。对 于后者，这些效应物多为半胱氨酸蛋白酶，它们针对的是防御信号途径的 重要乡且分。例如，丁香假单胞菌CP化wcfowo"as 效应物AvRpt2可
消除拟南芥属04ra&V/o; w'力RIN4蛋白(一种基本防御(basal defence)的调 节齐!J) (Axtell and Staskawicz， 2003)。其他效应物诱导可逆性的蛋白质修 饰YopJ/P/AvrBsT代表半胱氨酸蛋白酶家族，其自靶蛋白裂解遍在蛋白 样蛋白SUMO的羧基端，且由此干扰多种信号途径(Orth et al.， 2000)。 YopJ还乙酰化多种激酶的活化环结构域，由此干扰多种信号途径 (Mukherjec et al.， 2006)。目前还不清楚这些效应物如何改变特定宿主基因 的表达的机制。

发明内容
志贺菌需要炎症应答以起始对宿主细胞的感染，但反过来如果炎症应 答过强将清除细菌。因此，调节那些参与炎症应答并最终参与趋化因子表 达(其将影响适应性免疫应答使之趋向体液应答而非细胞应答)的基因，这 对于细菌是有利的。本发明人寻求确定志贺菌调节这些宿主基因表达的机制，在这一过程中本发明人鉴定了一种磷酸酶，其是新一类双特异性磷酸
酶(DSP)的成员。
0^ F基因定位于志贺菌的侵袭性质粒(Buchrieser， 2000)。该基因所编 码的蛋白质的功能迄今未知。本发明发现，^p尸编码磷酸酶。比较哺乳动 物DSP之间的氨基酸序列发现，在催化活性位点序列基序His-Cys-Xaas-Arg-Ser/Thr的内部及其紧邻处存在相似性。这一标志性序列基序也存在于 其他真核细胞和原核细胞中所发现的所有酪氨酸磷酸酶中(Kenndly， 2001)。引人注目的是，0^F基因编码的磷酸酶，即OspF磷酸酶，却并不 含有这一标志性序列，同时它与任何DSP或其他酪氨酸磷酸酶也未显示出 明显的序列相似性。OspF磷酸酶是新一类DSP的成员。了解志贺菌调节 宿主基因表达的机制有助于更有效地治疗志贺菌引起的痢疾以及那些由受 到OspF磷酸酶调节的宿主基因所介导的疾病。
在此给出的实施例显示，0^F基因编码磷酸酶，且该磷酸酶抗干扰那 些涉及细胞外信号调节的激酶(Erk)和丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)的 信号途径。随后的实施例还显示，OspF磷酸酶可降低多种宿主基因的转 录，其中包括那些编码c-fos和IL-8的基因。对于IL-8表达，这些实施例 证明，通过改变转录蛋白质如NF-kB和RNA聚合酶II (RNAPII)接近IL-8 启动子所需的染色质结构，所述OspF磷酸酶降低IL-8基因的转录。此 外，这些实施例还显示，OspF磷酸酶可下调白细胞介素-12 (IL-12)的表 达，这导致Th2型适应性免疫应答。
基于这一理解，本发明提供利用OspF磷酸酶来治疗疾病的方法、用 于鉴定那些调变OspF磷酸酶的活性的药剂的方法、用于鉴定那些模拟 OspF磷酸酶的活性的药剂的方法、用于调节免疫应答的方法、以及包含 OspF磷酸酶的免疫原性组合物。本发明还涉及含有灭活的0^F基因的弗 氏志贺菌菌株、包含该菌株的疫苗、以及治疗痢疾的方法。
具体地，在某些实施方式中，本发明提供一种治疗哺乳动物的癌症的 方法，其包括给所述哺乳动物施用包含OspF或模拟OspF活性的物质的药 物组合物。在某些实施方式中，本发明还提供用于治疗或预防炎性疾病的 方法，其包括给哺乳动物施用包含OspF或模拟OspF活性的物质的组合 物。在某些实施方式中，本发明提供用于治疗或预防移植相关性疾病的方 法，其包括给哺乳动物施用包含OspF或模拟OspF活性的物质的组合物。在某些实施方式中，本发明提供调节免疫应答的方法，其包括给哺乳动物
施用包含OspF或模拟OspF活性的物质的药物组合物。
在某些实施方式中，本发明提供筛选模拟OspF活性的化合物的方 法，其包括-
(A) 将化合物添加至培养的细胞中；
(B) 将细胞温育不同的时间；
(C) 检测细胞内的一或多种OspF蛋白调节活性；
(D) 比较所述化合物的蛋白调节活性和OspF的蛋白调节活性；禾口
(E) 鉴定模拟OspF活性的化合物。
在某些实施方式中，本发明提供筛选用于调变细胞的OspF活性的化
合物的方法，其包括
(A) 将化合物添加至培养的细胞中；
(B) 将细胞温育不同的时间；
(C) 检测细胞内的一或多种OspF蛋白调节活性；
(D) 确定哪些化合物改变细胞内的所述一或多种OspF蛋白调节活 性；禾口
(E) 选择调变OspF活性的化合物。
在某些实施方式中，本发明提供药物组合物，其包含OspF或模拟或 调变OspF活性的物质。在某些实施方式中，本发明提供弗氏志贺菌的菌 株，其中w/W基因是灭活的。在某些实施方式中，本发明提供治疗或预 防志贺菌感染引起的痢疾的方法，其包括给有需要的患者免疫接种弗氏志 贺菌菌株，其中w;^基因是灭活的。在某些实施方式中，本发明提供抗 癌治疗、抗炎治疗、或者对移植相关性疾病的治疗，所述治疗包括包含 OspF或模拟OspF活性的物质的药物组合物。在某些实施方式中，本发明
提供治疗或预防志贺菌感染的方法，其包括给有需要的患者施用降低 OspF活性的化合物。


本专利或申请文件含有至少一份彩图。经索取并支付必要的费用后， 有关部门可提供本专利或专利申请的含彩图的出版物。
图1所示为志贺菌灭活细胞核中的Erk。 (A) HeLa细胞未进行处理(ns)或以无毒株(VP-)或强致病性志贺菌菌株(WT)感染达指定的时间。进行 Western印迹分析，使用抗磷酸化MEKl (pMEKl)、 MEK1、磷酸化Erk (pErk)、 Erk、磷酸化c-Jun (pc-Jun)、 c-Jun或IicB-a抗体。(B)HeLa细胞以 VP-或WT菌株感染并以PMA (l吗/ml)共刺激指定的时间。进行Western 印迹，使用抗磷酸化苏氨酸183 (pT183)和磷酸化酪氨酸185 (pY185) Erk抗 体。(C)HeLa细胞以PMA刺激或以WT菌株感染指定的时间。裂解物以 MEKl抗体进行免疫沉淀，并使用GST-Erk2 K52R作为底物进行体外激酶 分析。进行Western印迹分析，使用抗磷酸化Erk (pErk)抗体。(D) HeLa 细胞按(C)处理指定的时间。裂解物以Erk抗体进行免疫沉淀，并使用髓磷 脂碱性蛋白质(MBP)作为底物进行体外激酶分析。进行Western印迹分 析，使用抗磷酸化抗磷酸化苏氨酸98 MBP (pMBP)抗体。磷酸化的MBP 的基础水平以星号标出。(E) HeLa细胞未进行处理(ns)，或者以PMA、 VP菌株、或WT菌株刺激30分钟；或者以PMA预处理15分钟并以VP 菌株或WT菌株(PMA + WT)感染15分钟。进行免疫荧光(IF)，使用单克 隆抗磷酸化Erk (红色/右侧)和多克隆抗Erk抗体(绿色/左侧)。
图2所示为OspF磷酸酶是双特异性磷酸酶，其直接对Erk进行去磷 酸化。(A)进行体外磷酸酶分析，使用来自不同菌株的上清液，以磷酸化 Erk2-GST作为底物。进行Western印迹分析，使用抗磷酸化Erk (pErk)抗 体。(B)进行体外磷酸酶分析，分别使用GST或带有组氨酸标签的OspF、 OspG或IpaH融合蛋白。按照(A)进行Western印迹分析。(C)在存在或不 存在lmM正钒酸盐或3nM岗田酸的情况下，将500ng的OspF与50ng的 磷酸化Erk2-GST在30°C混合1小时。进行Western印迹分析，使用抗磷 酸化苏氨酸183 (pT183)和磷酸化酪氨酸185 (pY^)Erk抗体。(D)如实施例 1所述，以MEKl磷酸化纯化的细菌表达的Erk2。 3微克"P-标记的Erk2 与l吗的OspF或MKP1在30°C温育30分钟，如SDS-PAGE所示，导致 底物的凝胶迁移率增加。(E)使用磷酸化Erk2抗体通过Western印迹验证 "P-标记的Erk2在pT183或pY"s残基处的去磷酸化。(F) OspF对Erk2去磷 酸化作用的稳态动力学分析。反应一式两份在存在100nM OspF (实线)或 MKP1 (虚线)的情况下、以不同浓度的"P-标记的Erk2底物、在30。C进 行10分钟。按照实施例1所述测定无机磷酸的释放，使用Kaleidagraph软 件使数据符合米曼氏方程式(Michaelis-Menton叫uation)。 (G)以剂量渐增的pRK5 myc-o^F、 ospF (H104L)、 ospF (H172L)转染HeLa细胞并以 PMA刺激。进行Western印迹分析，使用的是抗磷酸化Erk (pErk)、抗 Erkl/2或抗OspF的抗体。(H) GST-OspF或GST-OspF融合蛋白与50 ng pErk2-GST混合15分钟，30°C。按照(A)所述进行Western印迹分析。(I) 不同磷酸类似物对OspF活性的抑制。50 ng的pErk2-GST与10mM钒酸 盐、氟化铍(beryllofluoride) (lmM氟化钠与100pM氯化铍的组合)、氟化 铝(lmM氟化钠与100pM氯化铝的组合)预温育10分钟，30°C。
图3所示为OspF磷酸酶在体内选择性灭活Erk和p38 MAPK。 (A)以 渐增剂量的pRK5myc-OspF转染HeLa细胞并以PMA刺激。进行Western 印迹分析，使用的是抗磷酸化Erk (pErk)或抗Erkl/2的抗体。(B，C)以渐 增剂量的pRK5myc-OspF转染HeLa细胞并以TNF刺激。进行Western印 迹分析，(B)中使用的是抗磷酸化p38(pp38)或抗p38抗体，而(C)中使用 的是抗磷酸化JNK (pJNK)和抗p46 /p54 JNK抗体。(D,E)以野生型(WT) 或(o^ 。或反式互补菌株(o^F/pUC-OspF)转染Caco 2细胞。进行 Western印迹分析，(D)中使用的是抗磷酸化Erk (pErk)或抗Erkl/2抗体， (E)中使用的是抗磷酸化p38(pp38)或抗p38抗体。(F)以WT或owF突变 体或反式互补菌株(o^F/puc-OspF)转染Caco 2细胞。进行Western印迹 分析，使用的是抗磷酸化JNK 1/2 (pJNKl/2)或抗JNKl/2抗体。(G)进行 体外磷酸酶分析，使用的是50nM pErk2-GST、磷酸化p38-GST或磷酸化 JNK1组氨酸。按照(A)部分所述进行Western印迹分析。(H) HeLa细胞未 进行处理(ns)，或者以WT或a^F菌株刺激指定的时间。使用抗OspF抗 体进行IF。 (I) HeLa细胞未进行处理(ns)，或者以WT或os; F菌株刺激45 分钟。以抗核孔复合体(NPC)(红色)和抗OspF抗体(绿色)进行IF。
图4所示为基因阵列分析中被OspF调变的基因的分级聚类 (hierarchical clustering)。以WT、 os尸F突变体、或反式互补菌株感染Caco 2细胞2小时。各行代表基因，而各列代表样品。对应颜色标度，蓝色和 红色分别代表低和高信号表达值。
图5显示OspF是转录阻抑物，其干扰参与免疫应答的关键基因的表 达。(A)感染了 WT或oj/ F菌株的Caco 2细胞在指定时间的mRNA表达 的RT-PCR时间过程分析。(B)以WT或a^F菌株感染Caco 2细胞指定的 时间。以Western印迹分析c-fos蛋白表达的时间过程。(C)以WT、 o^F菌株、或反式互补菌株感染Caco 2细胞5小时。以酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定分泌入培养上清液的IL-8。 (D,E) Caco 2细胞感染了 WT或 OWF菌株。(D)通过凝胶迁移分析分析NF-kB活化的时间过程。(E)进行 超变动分析，使用来自未经剌激的细胞的核提取物(ns)或以WT或w;^突 变体菌株感染1小时的细胞的核提取物。核提取物用免疫前血清(PI)或 p50或p65抗体预温育。免疫前血清(PI)产生非特异性条带，如箭头所 示。指出了抗p50超变动条带("和抗p65超变动条带(-)。(F)Caco2细胞 未进行处理(ns)、或者以WT志贺菌菌株或0^F菌株在指定的时间感染。 进行Western印迹分析，使用的是抗IkB a抗体。
图6显示了 OspF以MAPK依赖性方式在组蛋白H3的丝氨酸10处靶 向组蛋白H3的磷酸化。(A) HeLa细胞未进行处理(ns)、或以WT或cw/7F 菌株在指定的时间感染。进行间接免疫荧光检测，使用的是抗磷酸化组蛋 白H3 S10多克隆抗体。(B) HeLa细胞经过双重胸苷阻断(2mM胸苷)达到 同步化，然后不进行处理(ns)或以WT或o^F菌株在指定的时间感染。使 用以下抗体探测免疫印迹抗H3磷酸化S10 (H3 pS10)、抗H3甲基K9-磷酸化S10(H3 metK9-pS10)、抗H3磷酸化S10乙酰基K14 (H3 p-S10/Ac-K14)、抗组蛋白H3多克隆抗pp38和pErk抗体。(C)以pRK5myc-OspF载 体转染HeLa细胞并以200nM岗田酸处理3小时。进行IF，使用的是抗 myc (红色)和抗H3甲基K9-pS10 (绿色)抗体。(D， E) OspF并非直接在丝 氨酸10对组蛋白H3进行去磷酸化。(D) 1微克小牛胸腺组蛋白(Sigma)与 300 ng的His-OspF或与120 U的人磷酸酶在30°C温育2小时。进行 Western印迹，使用的是抗metK9-pS10抗体。(E)将1微克metK9-S10肽 点样于硝酸纤维素膜上与缓冲液、5pg/ml的OspF、或2000U/ml的入磷酸 酶在30。C温育2小时。进行Western印迹，使用的是抗metK9-pS10抗 体。(F)以MEK1抑制剂U0126 (10 pM)或p38抑制剂SB203180 (2,5 joM) 或以这两者预处理HeLa细胞60分钟。细胞未进行处理(ns)或以cwpF菌株 感染30分钟。进行IF，使用的是抗H3甲基K9-pS10抗体。(G)以 pRK5myc-OspF载体转染HeLa细胞并以岗田酸(200nm)处理3小时。进行 IF，使用的是抗myc (红色)和抗H3甲基K9-pS10 (绿色)抗体。
图7显示OspF选择性损害组蛋白H3磷酸化并将NF-kB募集到IL-8 启动子。(A)将分离自超声处理的交联染色质片段的DNA用作Chip分析的输入物在2。/。琼脂糖/TAE凝胶上电泳。(B)自未进行处理的(ns)或在指定 的时间感染了 WT或w;^菌株的Caco 2细胞制备交联染色质片段。对于 各个时间点，将等量样品以无关IgG、抗H3甲基K9-pS10、或抗p65抗体 进行免疫沉淀。直方图所示为使用来自IL-8启动子区的扩增子通过实时 PCR分析得到的结果。数据被表示为与相同时间点使用已经被免疫沉淀的 相应IgG所得到的结果相比的相对丰度。下方的图所示为细菌攻击1小时 后得到的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。(C)数据按照图(B)方式给出，不同 之处在于等量样品以无关IgG或抗RNAPII抗体进行免疫沉淀。右侧的图 所示为细菌攻击1小时后得到的PCR产物。(D， E， F)等量样品以无关IgG 或抗H3甲基K9-pS10抗体进行免疫沉淀。直方图所示为使用来自CD44 (D)、 RLPO (E)或lKB-a (F)基因的启动子区的扩增子进行实时PCR分析得 到的结果。右侧的图所示为细菌攻击1小时后得到的PCR产物。(G)间接 免疫荧光检测OspF突变体。以pRK5 myc-o^F、 osp尸(H104L)、或cw/ F (1-221)转染HeLa细胞。进行IF，使用的是抗OspF抗体。(H)以pRK5 myc-WTo^F、 os/ F H104L、 os; F (l-221)转染HeLa细胞，并在指定的时 间以TNF-a刺激。等量样品以无关IgG或抗OspF抗体进行免疫沉淀。直 方图所示为以实时PCR分析扩增来自IL-8、 CD44、 RLP0和IicB-a基因的 启动子区的扩增子所得到的结果。
图8所示为在感染后24小时，自感染了这两种菌株的肺中经细胞分 选回收的巨噬细胞和树突状细胞(DC)所产生的细胞因子。将这些细胞在 37°C离体培养24小时，然后通过ELISA测定IL-10和IL-12的产生。细 胞分析的效率通过FACS测定。
图9所示为以BS176或M90T菌株感染WT和IL-10敲除小鼠。在感 染后不同时间点回收肺。通过平板接种分析测定细菌负荷，通过ELISA测 定IL-12和IFN-y的产生。
图10显示，以M90T或cw;^菌株感染的肺在感染后24小时被回收并 匀浆，并通过ELISA测定其中细胞因子的产生。
图11给出了保护性分析的结果。第一组感染了 M90T菌株，第二组 感染了o^F菌株，而第三组以水感染(对照组)。对小鼠进行免疫接种，每 只小鼠108细菌，3周后以每只小鼠107细菌对小鼠进行强化。强化后八 周，以致死量的细菌(每只小鼠5 x 108细菌)攻击小鼠并监测存活情况。图12所示模型显示了 OspF在特定基因座靶向组蛋白H3并调变促炎 性信号途径诱导的基因活化的程度。使用w/^菌株所获得的数据表明， 志贺菌通过仍不明确的机制触发导致MAPK活化的信号途径。诱导 H3pS10需要p38和Erk激酶活性。这种磷酸化发生于组蛋白H3尾部 (tail),组蛋白H3尾部在K9上是甲基化的，而在K14上是乙酰化的，由 此提供促进染色质解聚和转录机构主要成分(如NF-KB)募集的组蛋白代码 (Histone code)。 WT菌株通过其TTSS注入OspF。 OspF在细胞核内灭活 MAP激酶并抑制选定基因的H3pS10。这种修饰促使染色质凝聚并妨碍转 录机构接近启动子。感染WT菌株后组蛋白H3的乙酰化和甲基化状态仍 不明确，但OspF不直接影响K14的乙酰化。
图13显示了 OspF磷酸酶与其他推定的致病蛋白质(virulence protein) 的相似性。OspF与如下蛋白的序列比对两种推定的致病蛋白质，来自丁 香假单胞菌pSyr T DC3000 (NP—790745)和Psyr B728A (ZP—00128143);来 自紫色色杆菌(C/jramokzcfen'ww Wo/aceww)的VirA (NP_900978);来自肠 炎沙门氏菌鼠伤寒血清型(&/mowe//a serovar typhi)的5^ vC
(NP一490528)。相同的氨基酸以红色标示，而保守性取代为蓝色。
图14显示OspF抑制多形核白细胞募集并限制细菌对小肠上皮的入 侵。组织学切片来自以WT菌株(A， E)、 w;^突变体菌株(B, C， F)、或反 式互补型突变体菌株(B，G)感染8小时的兔的结扎的回肠袢。(A-D)，如实 施例1所述进行抗LPS免疫染色。在(A, B)中，箭头所示为与WT和反式 互补型菌株通常所见类似的局限性上皮脓肿。在(C, D)中，箭头指出了感 染w/7尸突变体菌株后上皮下粘膜固有层中细菌广泛散布的面积以及炎症 细胞在管腔中大量聚集。(E-F)进行抗NP5免疫染色，其证实，与在WT 和以puc-OspF反式互补的o乎F中所观察到的有限的浸润(E， G)相比，在以 0^F突变体菌株感染的肠袢中(F)，粘膜固有层有广泛的PMN浸润而肠腔 内没有PMN的大量移位。短棒等于10nm。
发明详述
细菌性痢疾，或称杆菌性痢疾，是由志贺菌引起的痢疾性综合征，志 贺菌是革兰氏阴性肠杆菌，属于肠杆菌科。这种人类疾病基本上发生于发 展中国家，主要累积5岁以下儿童。在过去的几年中，对其侵入过程分子和细胞学基础进行了大量研究(Nhieu， 1999 and Parsot, 1994)。 一连串复杂 的步骤使得细菌穿过肠道屏障侵入肠道上皮细胞，引起急性炎症，导致倡 导屏障的大量破坏。尽管炎症在志贺菌建立感染过程中发挥了重要的作 用，但过强的炎症应答也可能消灭感染。因此，志贺菌已经进化出了一种 机制，其通过独特的DSP，即OspF磷酸酶，来精细调节炎症应答。在 此，术语"OspF磷酸酶"和"OspF"指的是由0^F基因编码的蛋白质。志贺 菌有4个菌种，即弗氏志贺菌(S.^/7ex"eW)、宋内氏志贺菌(S. so""e/)、痢疾 志贺菌(S.办w"feWae)、和鲍氏志贺菌(51. Z)o;^//)。在优选的实施方式中， 志贺菌是弗氏志贺菌。
志贺菌owF基因的序列由Buchrieser在2000年公开。cw; F基因定位 于志贺菌的侵袭性质粒，其编码该磷酸酶。哺乳动物DSP之间的氨基酸序 列比对发现在催化活性位点序列基序His-Cys-Xaas-Arg-Ser/Thr内部及其邻 近区域具有相似性。这一标志性序列基序也存在于在其他真核细胞和原核 细胞中所发现的所有酪氨酸磷酸酶中(Kennelly， 2001)。引人注目的是， ospF基因编码的磷酸酶(OspF磷酸酶)，却并不含有这一标志性序列，同时 它与任何DSP或其他酪氨酸磷酸酶也未显示出明显的序列相似性。因此， OspF磷酸酶代表了一类新的DSP。来自各种变形细菌(proteobacteria)的功 能未知的蛋白质极少展现出与OspF具有类似性(图13):由肠炎沙门氏菌鼠 伤寒血清型的侵袭性质粒编码的SpvC (63%序列相同性)、由紫色色杆菌编 码的VirA(67。/。序列相同性)、和来自两种丁香假单胞菌菌株的两种推定的 致病蛋白质(40%序列相同性)。这些蛋白质的功能是未知的。
尽管细菌磷酸酶的初级结构极为多样，但比较分析发现这些蛋白质与 它们在真核细胞中的对应物展现出相似的结构特征(Kennelly, 2001)。迄今 已经鉴定了三种不同的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族，均具有其共同的催 化机制和活性位点序列传统PTP、低分子量PTP、和Cdc25 PTP。传统 PTP包括YopH和SptP，对磷酸化Tyr残基展现出高度的选择性(Kennelly， 2001)。来自非致病性蓝细菌(cyanobacterium)普通念珠藻(iVostoc 的IphP是唯一被报道与哺乳动物DSP具有某些功能和结构相似性的原核 细胞PTP。该蛋白质水解磷酸化丝氨酸和磷酸化酪氨酸残基(Potts et al.， 1993)。因此，对细菌的DSP罕有表征且此类双特异性的生物学意义仍不 清楚。OspF与其他DSP之间缺乏相似同源性不支持OspF起源于真核细胞。 不过，OspF与来自其他变形细菌的推定的致病蛋白质之间的相似性提示存 在一种共同的始袓，其可能是获得性的并保持被作为细菌的"选择优势" 而保留下来。来自普通念珠藻非致病性菌株的IphP蛋白是唯一已知由染色 体编码的DSP，且其磷酸酶活性可能针对的是对致病机制具有重要作用的 内源性细菌蛋白质(Potts et al.， 1993)。不同的是，OspF由220-kb质粒编 码，后者编码这些细菌的侵袭表型。因此其代表了目前已鉴定的第一种由 侵袭性质粒编码的DSP。当志贺菌感染细胞时，OspF被注入宿主细胞内 并移位至细胞核内，在此其模拟哺乳动物DSP的功能，在细胞核内使 MAP去磷酸化(图12)。
OspF蛋白的序列是已知的，可自NCBI数据库获得，登录号 CAC05773 (http:〃www,ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi)。在某些实施方式 中，本发明提供志贺菌的突变体菌株，其中wpF基因被破坏以防止该突 变体菌株表达OspF磷酸酶。该wp尸突变体按照布达佩斯条约的规定于 2005年7月12日保藏于法国微生物保藏中心(CNCM，即Collection Nationale de Cultures de Microorg肌ismes， 28, Rue du Docteur Roux,法国巴 黎)，保藏号为CNCM 1-3480。本发明还涉及该os;^突变体作为疫苗用于 质粒或预防志贺菌感染引起的痢疾的用途。在某些实施方式中，本发明还 提供表达OspF的质粒，即puc-OspF。在某些实施方式中，本发明提供表 达OspF-GST融合蛋白的质粒，即pGEX4T2。在某些实施方式中，本发明 提供表达OspF-组氨酸融合蛋白的质粒，即pKJ-OspF。在某些实施方式 中，本发明提供表达具有myc标记的OspF的质粒，即pRK5myc-OspF。 pRK5myc-OspF质粒按照布达佩斯条约的规定于2005年9月12日保藏于 法国微生物保藏中心(CNCM，艮卩Collection Nationale de Cultures de Microorganismes， 28, Rue du Docteur Roux,法国巴黎)，保藏号为CNCM I-3496。
OspF是DSP，这是因为该磷酸酶可对两种不同的氨基酸残基，即苏 氨酸和酪氨酸，去磷酸化。OspF的表达可影响多种蛋白质的活性。如下面 实施例所述，OspF通过影响信号转导途径和基因转录的不同机制调节蛋白 质功能，最终调节参与针对志贺菌感染的免疫应答的蛋白质。
第一种机制涉及通过使蛋白质的一或多个氨基酸残基去磷酸化而直接灭活蛋白质。例如，调节许多促炎基因表达的转录因子AP-1由Jun和Fos 家族蛋白之间的同二聚化或异二聚化形成。志贺菌感染阻断乙酸肉豆蔻佛 波醇(PMA)诱导AP-1活化的能力，并通过灭活MAPK Erk而阻抑c-Fos 的转录诱导。灭活OspF恢复PMA诱导c-Fos表达的能力，且如下面的实 施例所示，感染志贺菌后，OspF表达使得Erk自细胞桨迁移至细胞核内。 但由于被OspF去磷酸化，Erk在细胞核内保持其灭活状态。OspF去磷酸 化位于Erk的激酶亚结构域活化袢内的关键的磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸残 基。此外，OspF具有底物特异性，这是因为其灭活Erk和p38 MAPK，而 非JNK。
在第二种机制中，OspF防止使得作为细胞的转录机构的一部分的蛋 白质接近基因启动子所需的染色质结构改变。如实施例所示，OspF便是以 这种方式调节IL-8的。基因表达是转录、前体mRNA加工、信使核糖核 蛋白颗粒(mRNP)输出和翻译等协同过程的结果。此外，基因的转录状态 与其染色质的结构密切相关。将真核基因组包装成染色质限制了许多转录 所必需的调节蛋白接近基因组DNA的能力。四种核心组蛋白(H2A， H2B, H3和H4)的氨基端突出于核小体之外，这使得能够对组蛋白进行各种共 价转录后修饰，包括乙酰化、磷酸化和甲基化。这些修饰改变了染色质纤 维的电荷环境，或者使得组蛋白成为染色质重构因子和/或调节基因表达的 转录因子的停泊位点(Cheung et al., 2000)。
重要的是，特异性组蛋白尾部修饰可对染色质相关蛋白产生协同性或 拮抗性相互作用亲和力，而染色质相关蛋白又决定了具有转录活性和转录 沉默的染色质位点之间的动态转变。在转录或翻译水平的基因调节以外， 组蛋白蛋白质的修饰状态提供了基因调节的另一层面或代码(综述参见 Jenuwein and Allis， 2001)。这种"组蛋白代码"因此决定了特定基因的转录状 态。
例如，组蛋白H3尾部(其中赖氨酸9已经被甲基化)的丝氨酸10的磷 酸化有利于与异染色质蛋白1 (HP1)中所含的染色质域(chromodomain)的 相互作用。不过，对于乙酰化的赖氨酸14，这一磷酸化事件导致该蛋白质 离位，提示形成了组蛋白代码基序，其可以克服HP1介导的染色质凝聚和 基因沉默(Mateescu et al.， 2004)。丝氨酸10磷酸化也发生于与立即早期(正) 基因(如c-fos)以及NFkB依赖性促炎性细胞因子和趋化因子基因亚组(如IL-8)的启动子相结合的小部分H3分子(Clayton et al.， 2000; Saccani et al.， 2002; Clayton and Mahadcvan， 2003)。在这两种情况中，丝氨酸10磷酸化 根据刺激物的不同可由Erk或p38 MAPK信号途径诱导(Thomson et al., 1999)。重要的是，MAPK诱导的H3磷酸化通过仍不清楚的机制以启动子 特异性的方式发生(Saccani et al., 2002)。在这些启动子上，组蛋白H3在丝 氨酸IO的磷酸化为组蛋白乙酰基转移酶(HAT)产生了停泊位点，而HAT 将乙酰化赖氨酸14。这些修饰有助于染色质重构酶的结合，通过破坏核小 体结构而提高启动子的可接近性(Saccani et al.， 2002)。因此，MAPK依赖 性组蛋白H3磷酸化对于在选择性启动子位点诱导染色质重构而言似乎是 一个关键事件，这为选择性调节参与免疫应答的NFkB应答基因的亚组的 表达提供了有效的策略。
的确，如实施例所示，OspF通过在细胞核内直接使Erk和p38 MAPK 去磷酸化，损害组蛋白H3在丝氨酸10的磷酸化，来调节IL-8表达。 OspF被注入靶细胞并移位至细胞核内，在此其改变了染色质重构以及转录 机构所必需的组分如NF-kB和RNA聚合酶II的募集。细胞刺激诱导OspF 直接定位于选定的启动子例如IL-8启动子，使得OspF能够以基因特异性 方式预防MAPK依赖性H3磷酸化。与其负调节IL-8的能力相一致， OspF负调节多形核白细胞的募集，并有助于限制细菌侵入肠道细胞。通过 OspF改变组蛋白代码使得志贺菌能够抑制主要参与免疫应答的选择性基因 池，由此提供了一种精细的策略，用于"雕刻出"最适合其建立感染所需 的转录应答。
组蛋白H3可能是DSP活性的直接底物这一点是可能的。不过，更大 的可能性是，由于其能够阻断Erk和p38 MAPK途径，因此OspF防止了 组蛋白H3在SerlO的磷酸化。实际上，这两种MAPK是细胞核激酶MSK (丝裂原和应激活化的激酶)的两种主要激活物，而MSK是在Ser 10直接 磷酸化组蛋白H3的主要组蛋白激酶(Thomson etal., 1999)。因此，志贺菌 可使用OspF有效防止形成磷酸化的组蛋白H3。
重要的是，OspF对组蛋白H3磷酸化的这种影响并非是随机的，而是 针对特定的启动子。这种特异性的原因可能在于其具有阻断MAPK的能 力。MAPK可以通过与序列特异性转录因子的相互作用被募集到各个启动 子，如酿酒酵母(S. ce"v^ae) p38 MAPK同系物Hogl中所示那样(Alepuzetal.，2001)，并可启动导致位点特异性修饰的信号途径。此外，高分辨率 共焦显微镜方法已经发现，活化的MSK1可通过仍不清楚的机制磷酸化特 定一组组蛋白H3 (Dyson et al.， 2005)，这提示组蛋白激酶在特定基因座的 空间分布可决定位点特异性组蛋白H3磷酸化。因此，注入OspF使得志贺 菌能够抑制很窄的一组基因，特别是需要启动子处的染色质去致密化以实 现成功的基因转录的那些基因，如IL-8。
对于IL-8基因，已经提示组蛋白H3的磷酸乙酰化为染色质重构蛋白 的布罗莫结构域(bromodomain)提供了停泊位点，后者可参与将启动子完 全暴露并允许NF-KB成功募集(Saccani et al.， 2002)。通常，布罗莫结构域 是一种保守性蛋白结构域，其能够识别组蛋白中的乙酰赖氨酸部分。布罗 莫结构域存在于多种染色质重构蛋白中，并与组蛋白的乙酰赖氨酸残基相 互作用。实施例中的结果与此模型相符并说明形成K9甲基化的磷酸乙酰 化组蛋白H3是促进染色质去致密化的组合模式，由此促进NF-kB和RNA 聚合酶II (RNAPII)共同募集于启动子(图12)。
图4的基因阵列分析显示，OspF特异性下调主要转录激活物如AP-1、 CREB、 BCL2相关性抗凋亡蛋白、和主要促炎性基因(major proinflammatory genes)如CCL20和IL-8的表达。AP-1是包含c-fos的促炎 性转录因子家族(在图4中称为v-fos FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同系物)。图 5B也通过RT-PCR显示OspF的灭活强烈上调了 c-fos mRNA表达。已经 报道了多种肿瘤中存在AP-1转录因子的过表达或过度活化。例如，AP-1 参与了结直肠癌(Ashida， 2005)。
至于CREB， ATF3是CREB转录因子家族成员，且如图4所示， OspF下调其mRNA表达。
至于抗凋亡的BCL2相关蛋白质，如图4所示，OspF下调MCL-l (髓 性细胞白血病序列)的表达，MCL-l是BCL-2抗凋亡蛋白。MCL-1上调见 于多种癌症，包括淋巴瘤(Bai, 2006)和肝细胞癌(Fleischer, 2006)。图4还 显示OspF下调CCL20，也称为趋化因子(C-C基序)配体20。 CCL20是树 突状细胞(DC)化学引诱物(chemoattractant)，已知其通过诱导产生干扰素 Y而在控制细菌播撒方面具有重要作用。CCL20还参与建立有效的1型适 应性应答。不过，在炎症性肠病(IBD)如克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎 (UC) (Lee， 2005)， DC对T细胞的活化被认为在所述疾病的发生和维持过程中起了关键的作用。因此，已经研究了这一趋化因子在IBD中的表达， 在所述疾病中鉴定到其过表达(Kaser， 2004)。
至于IL-8，就志贺菌而言，IL-8表达对于清除细菌是至关重要的。例 如在IBD中，在UC和CD中均发现肠道IL-8浓度升高与疾病活性是相关 的(Nielson, 1997)。
如图10所示，OspF还在体内下调IL-12的产生。有提示CD伴有表现 为白细胞介素-12 (IL-12)产生增加的过度的Thl细胞因子应答(Schmidt, 2005)。目前正在进行抗IL-12抗体的临床试验(Ardizzone， 2005)。
除了影响CCL20表达和IL-8表达，志贺菌还以其他方式调节宿主的 免疫应答。天然免疫是初次感染痊愈所必需的，并在诱导适应性免疫中发 挥关键作用(综述请参见Janeway， 2002)。天然免疫保护哺乳动物，天然免 疫是这样一种免疫应答，其广泛对抗入侵的病原体并诱导所有不直接由淋 巴细胞介导的各方面免疫。诸如吞噬性巨噬细胞和天然杀伤细胞等细胞介 导天然免疫应答，后者不同于"获得性免疫"。获得性免疫涉及的是免疫 系统中对特定病原体具有特异性的组成部分。这些组成部分包括细胞免疫 和体液免疫。在细胞免疫中，T细胞应答于由被感染的细胞呈递的特异性 抗原。在体液免疫中，B细胞产生抗体，后者可结合于特定病原体上的抗 原。细胞因子和趋化因子是天然和适应性免疫之间的关键联系(Mackay, 2001)。除了诱导炎性过程以外，志贺菌感染也诱导特异性体液免疫。这种 体液应答的特征在于在肠道水平产生了特异性的分泌型IgA (SIgA)，而在 血清中为IgG(Phalipon， 1999)。
使用减毒活疫苗进行的人类试验显示所诱导的体液应答的强度取决于 疫苗菌株所引发的炎症应答的强度。换言之，高度减毒的活疫苗候选物诱 导弱的炎症应答并由此诱导弱的体液应答(综述请参见Phalipon, 2003)。但 志贺菌的天然感染所诱导的体液保护持续时间短，提示其触发的细胞免疫 不充分。本发明人研究了志贺菌初次感染时诱导的急性炎症对家里特异性 免疫和保护性免疫的影响。
如下面的实施例所示，OspF在上皮细胞中发挥转录阻抑物的作用来控 制促炎性应答。OspF还负责控制感染后早期所见的IL-12的产生(有可能 是由树突状细胞产生的)。OspF诱导的IL-12抑制导致IFN-Y的产生被抑 制，后者是对志贺菌感染有害的细胞因子。志贺菌抑制对不利的Thl型应答的诱导，使得其能够在宿主中存活。这一 Thl型途径随后迫使适应性免 疫在免疫抑制的环境下朝着体液应答发展，这是因为IL-10是感染后早期 由侵袭菌株产生的主要细胞因子。因此，志贺菌避免了产生有可能有效抵 抗细菌感染的细胞免疫应答。
实际上，转录分析显示OspF下调免疫基因例如IL-8和CCL20、和某 些促炎性早期应答基因例如促炎性AP-1家族成员c-fos以及编码早期生长 因子家族成员(Early Growth factors family members)的基因的表达。OspF 与来自丁香假单胞菌番茄致病变种的两种功能未知的推定致病蛋白质具有 显著的同源性。丁香假单胞菌是叶枯病以及多种相关的植物疾病的致病因 子。植物病原体注入若干III型效应物，它们最初被称为无毒(Avr)蛋白 质，因为它们被植物防御系统的称为抗性(R)蛋白质的组分所识别。R蛋白 与包括Nod蛋白在内的病原体哺乳动物受体具有结构同源性，并触发植物 防御应答(Numberger et al., 2004)。有趣的是，丁香假单胞菌HopPtoD2 III 型效应物是酪氨酸磷酸酶，其能够以目前未知的机制抑制Avr介导的植物 免疫应答，提示存在病原体通过获得能够对抗Avr信号途径的额外的III 型效应物而获得了逃避天然免疫系统的真核细胞监视系统的能力的可能性 (Espinosa et al.， 2003)。类似地，志贺菌可能已经获得了某些能够对抗由 Nodi启动的促炎性信号途径的III型蛋白效应物如OspF，提供了上皮细胞 中的一种典型的转录特征(图12)。
对志贺菌的生物学益处是其自身的生存，这是因为在体内中和IL-8导 致细菌在粘膜固有层内过度生长并大量移位通过通向肠系膜血液的肠道上 皮细胞屏障(Sansonetti et al.， 1999)。不过，在志贺菌感染的早期，IL-8起 到了关键的作用，这是因为其是多形核白细胞(PNN)的重要化学引诱物， 其有助于细菌通过上皮细胞基底外侧极而侵入。因此，OspF对IL-8的转 录调节可以被时间性调节。细致的研究已经发现病原体可利用宿主的蛋白 质降解机制，以便控制其自身效应蛋白的半衰期，这提供了一种对毒力效 应物功能的时间性调节(Kubori and Galan， 2003)。
除了OspF本身，本发明还提供模拟OspF活性的物质。在某些实施方 式中，模拟OspF活性的物质具有一或多种上述的蛋白调节活性。在某些 实施方式中，模拟OspF活性的物质具有两种或更多种上述的蛋白调节活 性。在某些实施方式中，模拟OspF活性的物质具有三种或更多种上述的蛋白调节活性。蛋白调节活性是调节蛋白质活性的能力。此种调节可通过 不同的机制而实现，这包括但不限于，直接修饰蛋白质例如去磷酸化，或
通过调节编码所述蛋白质的基因的表达。模拟OspF活性的物质并不限于 是另一种蛋白质，其也可以是，例如，化学物质。在某些实施方式中，蛋 白质调节活性包括但不限于调节AP-1、 CREB、 RPAp32(STAT激活物)、 BCL2相关性抗凋亡蛋白、和主要促炎性基因如CCL20、 IL-8、和IL-12的 蛋白质表达和/或活性。
如果化合物能够提高或降低至少一种OspF的蛋白调节活性，则该化 合物调节OspF的活性。在某些实施方式中，本发明提供治疗或预防志贺 菌感染的方法，包括给有需求的患者施用降低OspF活性的化合物。在某 些实施方式中，提高OspF活性的化合物与OspF或模拟OspF的化合物组 合用于药物组合物中。
在某些实施方式中，模拟OspF活性的物质是OspF变体。在此，术语 "OspF变体"指的是一种蛋白质，其具有的氨基酸序列是具有一或多个缺 失、取代或添加的OspF的氨基酸序列。在某些实施方式中，模拟OspF活 性的物质是OspF片段。在此，术语"OspF片段"指的是具有氨基端和减羧 基端缺失的OspF蛋白。在某些实施方式中，片段的长度为至少5至238 个氨基酸。可以理解，在某些实施方式中，片段的长度为至少5、 6、 8、 10、 14、 20、 50、 70、 100、 150、 200、或238个氨基酸。
在某些实施方式中，模拟OspF活性的物质是OspF肽模拟物(OspF peptidomimetic)。在此，术语"OspF肽模拟物"指的是含有非肽结构元件的 化合物，其中所述化合物模拟OspF的一或多种生物学功能。此类化合物 通常借助于计算机分子建模来开发。与具有治疗作用的肽具有结构相似性 的肽模拟物可产生类似的治疗或预防作用。通常，肽模拟物在结构上类似 于一种典范多肽(即具有生化特性或药用活性的多肽)，例如OspF，但其一 或多个肽键任选地通过本领域已知的方法由选自以下的连键替换-CH2-NH-画、—CH2-S—、 一CH2-CH2—、誦國CHNCH國(顺式和反式)、~COCH2—、— CH(OH)CH2--、和—CH2-SO--。在某些实施方式中，可将共有序列中的一 或多种氨基酸系统性替换为该种氨基酸的D-氨基酸(如D-赖氨酸代替L-赖 氨酸)，以产生更稳定的化合物。
OspF能够调节Erk和p38以及免疫调节性细胞因子如IL-8、 IL-12、和CCL20的活性，这提示OspF可为患有涉及Erk或p38信号转导的疾病 和涉及炎症的疾病的那些患者提供有益的治疗。此类疾病包括但不限于癌 症(包括但不限于结肠癌和胰腺癌)和克罗恩病。在特定的实施方式中， OspF用作免疫抑制剂来预防移植排异或降低其严重程度。在某些实施方式 中，OspF用于调节免疫应答。
在一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的癌症的方法，其包括 给所述哺乳动物施(患有癌症的患者)用包含OspF或模拟OspF活性的物质 的药物组合物，其中所述治疗使得疾病减轻。在一个实施方式中，本发明 为具有发生癌症的风险的哺乳动物提供预防癌症的方法，包括给所述哺乳 动物(患有癌症的患者)施用包含OspF或模拟OspF活性的物质的药物组合 物，其中所述治疗预防或延迟疾病的发生。疾病减轻可以表现为多种征 象，包括癌症症状减轻，例如乏力减轻或肿瘤体积縮小。有效量是导致症 状减轻或者症状消失的量。根据疾病的类型、治疗开始时疾病的分期以及 其他因素例如患者的年龄和体重等，本领域人员能够确定所施用的合适剂 量和方案。在某些实施方式中，本发明提供抗癌治疗，其包含OspF或模 拟OspF活性的物质的药物组合物。在某些实施方式中，本发明提供抗炎 治疗，其包含OspF或模拟OspF活性的物质的药物组合物。在某些实施方 式中，本发明提供移植相关性疾病的治疗，其包含OspF或模拟OspF活性 的物质的药物组合物。
在某些实施方式中，本发明提供用于治疗炎性疾病的方法，其包含给 哺乳动物施用有效量的包含OspF或模拟OspF活性的物质的组合物。在某 些实施方式中，本发明提供预防炎症的方法，其包含给具有发生炎性疾病 的风险的哺乳动物施用有效量的包含OspF或模拟OspF活性的物质的组合 物。炎性疾病包括但不限于克罗恩病、类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性 肠病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、银屑病、和增生性狼疮性肾炎。
在某些实施方式中，本发明提供治疗移植相关性疾病的方法，其包含 给哺乳动物施用有效量的包含OspF或模拟OspF活性的物质的组合物。在 某些实施方式中，本发明提供预防移植相关性疾病的方法，其包含给将要 接受移植物的哺乳动物施用有效量的包含OspF或模拟OspF活性的物质的 组合物。此类疾病包括但不限于移植物抗宿主病、实体器官移植(例如心 脏、肝脏、皮肤、肾脏、肺(肺移植物气道闭塞))或其他移植物(包括骨髓移植和基因治疗)引起的并发症。
在一个实施方式中，本发明提供筛选用于调变细胞的OspF活性的化 合物的方法，其包括-
(A) 将化合物添加至培养的细胞中；
(B) 将细胞温育不同的时间；
(C) 检测细胞内的一或多种OspF蛋白调节活性；
(D) 确定哪些化合物改变细胞内的所述一或多种OspF蛋白调节活 性；和
(E) 选择调变OspF活性的化合物。
在某些实施方式中，所述细胞选自HeLa细胞、Caso 2细胞、和免疫 系统的细胞。免疫系统的细胞包括但不限于T细胞、B细胞、和抗原呈递 细胞。
在一个实施方式中，本发明提供筛选模拟OspF活性的化合物的方 法，其包括
(A) 将化合物添加至培养的细胞中；
(B) 将细胞温育不同的时间；
(C) 检测细胞内的一或多种OspF蛋白调节活性；
(D) 比较所述化合物的蛋白调节活性和OspF的蛋白调节活性；和
(E) 鉴定模拟OspF活性的化合物。
细胞内的OspF蛋白调节活性包括但不限于调节AP-1、 CREB、 RPA p32 (STAT激活物)、BCL2相关性抗凋亡蛋白、和主要促炎性基因如 CCL20、 IL-8、和EL-12的蛋白质表达和/或活性。本领域人员能够利用本 领域熟知的技术来检测基因转录调节，这些技术包括Northern印迹和基于 PCR的RNA检测。由于编码那些因OspF表达而受到影响的蛋白质的核 酸序列是已知的，因此本领域人员能够常规地设计出可扩增各种耙蛋白的 部分或整个mRNA序列的PCR引物。本领域人员还能够利用熟知的技术 来检测去磷酸化，例如利用如下面实施例中所使用的Western印迹技术。
在某些实施方式中，药物组合物包含OspF和/或模拟或调变OspF活 性的物质、和药用可接受载体。药用可接受载体是本领域已知的。在某些 实施方式中，药物组合物中的主要运载物或载体可以是水性或非水性的。 例如，在某些实施方式中，合适的运载物或载体可以是注射用水、生理学盐溶液或人造脑脊液，可以补充用于肠外施用的组合物中常见的其他物 质。在某些实施方式中，其他的示例性运载物是中性缓冲盐水或与血清白
蛋白混合的盐水。在某些实施方式中，药物组合物包含pH为大约7.0-8.5 的Tris缓冲液或pH为大约4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其还可以包括山梨醇 或其合适的代用品。在某些实施方式中，药物组合物是水性或液体制剂， 其包含pH为大约4.0-5.5的乙酸盐缓冲液、多元醇，并任选地包含表面活 性物质，其中所述组合物不包含盐(例如氯化钠)，且其中所述组合物对于 患者是等张的。多元醇的实例包括但不限于蔗糖、葡萄糖、山梨醇、和甘 露醇。表面活性物质的实例包括但不限于聚山梨醇酯。在某些实施方式 中，药物组合物是水性或液体制剂，其包含pH为大约5.0的乙酸盐缓冲 液、山梨醇、和聚山梨醇酯，其中所述组合物不包含盐(例如氯化钠)，且 其中所述组合物对于患者是等张的。某些示例性组合物见于，例如，美国 专利6,171,586。其他药用载体包括但不限于油，包括石油(petroleum oil)、 动物油、植物油、花生油、豆油、矿物油、麻油等等。水性的葡萄藤和甘 油溶液也可用作液体载体，特别是注射用溶液。在某些实施方式中，可制 备用于储存的包含OspF的组合物(含有或者不含至少一种另外的治疗剂)， 这可通过将选定的具有所需纯度的组合物与任选的配制剂混合 (及ew/wgtow's尸/zarmacewft'ca/ 5bz'ewces， sw; ra)，制备为冻干块状物或水性溶 液的形式。此外，在某些实施方式中，可使用合适的赋形剂溶液(如蔗糖) 作为稀释剂，将包含OspF的组合物(含有或者不含至少一种另外的治疗剂) 配制为冻干物(lyophilizate)。例如，药物组合物可以是一种佐剂，其中 OspF与其他佐剂成分协作，调节针对抗原的免疫应答。
本说明书中引用的全部参考文献附于说明书后权利要求书之前。在此 通过引用将这些出版物以其全文内容并入本申请以更加充分地描述本发明 所属的领域。如果所引用的参考文献的教导与本申请的教导有任何冲突， 则以本申请的教导替代所引用的参考文献的教导。
以下实施例用于说明o^F基因编码一种磷酸酶，且该磷酸酶通过蛋 白质修饰和转录抑制而调节蛋白质功能。这些实施例的目的在于帮助本领 域人员利用OspF磷酸酶，其无意于以任何方式来限制本发明的范围。
实施例l:材料和方法細應培养。使用了来自结肠癌的人肠道上皮细胞系Caco-2以及HeLa 细胞。通过双重胸苷阻断进行细胞同步化，方法如前所述(Harper， 2005)。
菌妹。使用了弗氏志贺菌血清型5a的野生型(WT)侵袭菌株和缺乏 220kB侵袭性质粒的该WT菌株的非侵袭性变体(VP-)。此前已经报道了 z》a突变体菌株(Mavrisetal.，2002a)。为了构建os; F突变体，将PCR扩增 得到的含有o^F的61至420位核苷酸的DNA片段克隆至自杀质粒 pSW23T的屈al和五coRI位点之间，产生pSWOspFTr。通过结合将该质 粒转移至WT菌株WT-Sm。通过将含有ow尸基因的PCR片段插入至 pUC18的五coRI和///"dill位点之间，形成pUC18-OspF，由此构建表达 a^F基因的质粒。该质粒用于互补w;^突变体。
质粒和圣4;质沌化。通过PCR扩增owF编码序列并克隆至pKJl的 TVcoI和位点之间以构建编码OspF-His的pKJ-OspF。类似地，携带 ospF编码序列的PCR片段克隆至pGEX4T2的BamHI和￡coRI位点之间 以构建编码GST-OspF的pGEX4T2-OspF。 His标记的和GST标记的OspF 重组蛋白质纯化自携有pKJ-OspF或pGEX4T2-OspF的大肠杆菌衍生菌。 将携带编码序列的PCR片段克隆至pRK5myc的5amffl和五coRI位 点之间以构建pRK5myc-OspF，其编码myc标记的OspF (myc-OspF)。根 据Quick-Change定点诱变试剂盒(Stratagene)的标准程序产生定点诱变。
间接免痰焚光。细胞在含3.7M多聚甲醛的PBS中固定10分钟，在含 0.5% Triton-X的PBS中打孔(permeabilized).使用了如下抗体抗磷酸化 p42/p44抗体(Sigma);抗p42/p44、抗磷酸化组蛋白H3 S10 (Upstate Cell Signaling)、抗乙酰组蛋白H4 (Lysl4) (Upstate Biotechnology)的抗体。抗 H3甲基K9-磷酸化S10抗体已经被披露(Mateescu et al.， 2004)。根据生产 商(Eurogentec)的说明以完整分子免疫小鼠产生抗OspF抗体。
喇备"P-标记的Erk2激酶威物。将偶联于珠的500呢纯化的GST-Erk2与20吗His6标记的活化的MEK1 (Upstate Cell Signaling)在含100一 ATP (y-33P ATP， 3000 Ci/mmol)的激酶缓冲液(50 mM Tris pH 7.5, 2 mM DTT， 10 mM MgCl2)中在30°C温育2小时，实现GST-Erk2融合蛋白的体 外磷酸化。将珠以30 ml的IX PBS洗涤5次并在50mM Tris pH 8， 10mM 谷胱甘肽和10%甘油中洗脱。将各级份在50mM Tris pH8, 50mM NaCl和 10%甘油中透析过夜以除去残余ATP。体外裤睃酶分析。在含有与lOOnM OspF或MPK1 (Upstate Cell Signaling)温育的不同浓度的"P-标记的Erk2的磷酸酶分析缓冲液(0.1M 乙酸钠，50mM Tris pH8)中进行33P标记的Erk2磷酸酶分析。在预实验中 确定"P-标记的Erk2被OspF去磷酸化的时间过程，并指出在10分钟时达 到底物水解的最大速率。因此，通过加入磷酸酶起始反应，在30°C温育 10分钟，并通过加入200^1 20%的冷三氯乙酸。样品以10，000 xg离心， 将200W的上清液与5 ml的闪烁液混合以进行放射性测定。将产生的产物 (无机磷酸)保持在初始底物浓度的5%以下。将含有Erk2底物和无磷酸酶 缓冲液的反应用作各数据点的空白。使用Kaleidagmph软件使数据符合米 曼氏方程式。
激酶分析。如文献所述进行激酶分析(Philpott et al.， 2000)。使用的底 物为5ng的髓磷脂碱性蛋白质(MBP)或2昭无活性形式的Erk2，其中52 位的Lys变为Arg (Lys52Arg) (Upstate Cell Signalling)。
凝肷逸移和超史动卖猃。如文献所述进行核提取物的凝胶迁移分析 (Philpott et al.， 2000)。对于超变动分析，将核提取物与抗p50 (U41)和抗 p65 (1207-2)抗体或无关IgG温育。
Western印逸分析。通过在尿素缓冲液(8M尿素，10mM tris pH7.4， lmMEDTA， ImM DTT和蛋白酶抑制剂)中裂解细胞而使组蛋白溶解。使 用了如下抗体抗磷酸化Erkl/2、抗磷酸化p38、抗磷酸化SAPK、抗磷 酸化MEK1/2抗体(Cell Signaling Technology)、抗磷酸化苏氨酸183抗体 (Promega)和抗磷酸化酪氨酸185 (Upstate Cell Signaling) Erk抗体、抗IkB-a抗体(Santa Cruz Biotechnology)、抗磷酸化(S10)-乙酰基(K14)组蛋白H3 多克隆抗体(Upstate Biotechnology)、和抗组蛋白H3抗体(Abcam)。
基闳总片杂夫和分析。如文献所述进行RNA的合成、杂交和标记 (Pedron et al., 2003)。使用dChip以dChip软件(Li and Wong， 2001)进行基 线(WT感染的细胞)和实验(突变菌株或反式互补菌株感染的细胞)之间的 比较分析，采用非配对Welch t-检验，p-值阈值为0.05，以及信号比值的 对数(Signal Log Ratio, SLR)阈值为0.6。 SLR阈值相当于1.5倍的变化。 该软件也用于分级聚类，使用欧几里得距离和平均值作为连锁(linkage)方 法。聚类之前要对一种基因的表达值在所有样品之间进行标准化使得均值 为零。然后相对于该均值划分增加值或降低值的范围。柴色质免疫沉波和走量卖对PCR (QPCR)。提取甲醛固定的Caco 2细 胞以除去非固定成分。对经超声处理的相当于5xl06细胞的染色质进行免 疫沉淀，使用的是3 pg的无关IgG、抗H3甲基K9-pS10、抗p65 (1226)和 抗RNA聚合酶II (SC-899-Santa Cruz biotechnology)多克隆抗体。充分洗涤 后，将交联逆转，并通过酚/氯仿法分离核酸。将等量样品用于QPCR。 QPCR使用了 SYBR Green试剂盒(Applied),按照生产商的说明进行。使 用了以下启动子特异性IL-8:有义5，-AAGAAAACTTTCGTCATACTCCG-3， (SEQ ID NO. 1) 反义5，-TGGCTTTTTATATCATCACCCTAC-3， (SEQ ID NO. 2)CD44:有义5，-TCCCTCCGTCTTAGGTCACTGTTT國3， (SEQ ID NO. 3) 反义5，國CCTCGGAAGTTGGCTGCAGTTT画3， (SEQ ID NO. 4)hRLPO:有义5，-ACAGAGCGACACTCCGTCTCAAA-3， (SEQ ID NO. 5) 反义5，-ACCTGGCGAGCTCAGCAAACTAAA-3， (SEQ ID NO. 6)lKB-a:有义5，-ATCGCAGGGAGTTTCTCCGATGA-3， (SEQ ID NO. 7) 反义5，-GGAATTTCCAAGCCAGTCAGACCA-3， (SEQ ID NO. 8)。 将PCR样品在95。C预温育10分钟，随后45个循环是94。C15秒，60。C50秒，和72。C60秒。末次循环后继以最后的延长温育，72°C 10分钟。体内感柴和組织学。如文献所述进行兔肠袢感染(Perdomo et al.， 1994b)。将5 x 109细菌悬液(0.5 ml)注入5cm的兔小肠肠袢内。将肠袢放 回腹腔，并在8小时后对兔实施安乐死。各个细菌菌株在三只兔中进行测 试。如文献所述以苏木精进行组织染色，并进行组织病理学分析(Perdomo et al. 1994b)。以抗弗氏志贺菌5a LPS抗血清进行免疫标记实验，并以抗 NP5抗血清(Pharmingen)对PMN进行染色。实施例2:志贺菌灭活Erk并隔离细胞核内的ErkMAPK途径通过磷酸化转录因子、共调节因子和染色质重构组分而在 真核细胞中发挥重要的调节基因表达的作用。哺乳动物细胞中MAPK的三 种主要亚家族包括Erk 1和2、 JNK 1、 2、和3、 p38蛋白(p38a/p/VS)。 MAPK激酶(MAPKK)通过磷酸化位于MAPK的活化袢结构域中的TEY 序列的苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基而活化MAPK。 MAPKK反过来通过由MAPKK激酶(MAPKKK)对丝氨酸(Ser)和Thr残基进行磷酸化而被活 化。在静止细胞中，两种亚型的MAPK，即Erkl和Erk2，是无活性的并 通过与它们的上游激活物激酶MEK1直接结合而保留于细胞浆中。细胞活 化后，活化的MEK1磷酸化TEY序列上的Erkl和Erk2，使得MEK-Erk 复合物解离，随后Erk移位至细胞核内(Burack and Shaw， 2005)。下面的实 验说明了志贺菌如何调变HeLa细胞中MAPK的活化。以野生型侵袭性志贺菌菌株(WT)或缺乏侵袭性质粒的非侵袭性VP-菌 株感染HeLa细胞。为了验证侵袭性质粒己被除去，对c-Jun磷酸化进行监 测。侵袭性WT菌株诱导c-Jim蛋白(JNK激酶的重要靶蛋白)磷酸化，而非 侵袭性VP-菌株没有诱导c-Jim磷酸化(图1A，比较第5和10道)。感染 WT菌株还导致lKB-a降解，这为文献中所述的IF-kB (IKK)途径的活化 (Philpottetal.,2000)提供了证据(图1A，道7-11)。使用以下两种抗体之一确定志贺菌感染对两种激酶MEK1和Erk 1/2 磷酸化的影响特异于亚结构域VIII的活化袢中两个Ser残基(S^和S221) 被双磷酸化的MEK1的抗体，或者特异于T^EY^序列被双磷酸化的 Erkl/2的抗体。志贺菌感染诱导形成其两个丝氨酸残基被磷酸化的活性形 式的MEK1 (图1A，道7-11)。不过，活化的MEK1未能诱导Erk磷酸化 (图1A)。此外，使用检测Eric I/2的磷酸化Thr183 (pT)或磷酸化Tyr185 (pY) 残基的抗体证实，在感染WT的细胞中，Raf激酶的强活化剂PMA未能明 显诱导Erk在两个残基发生磷酸化。相反，感染了 VP-菌株的细胞确实出 现Erk磷酸化(图lB，比较第2-4道与第6-8道)。总之，这些结果提示WT 菌株能够破坏MEK1下游的信号途径。实际上，激酶分析证实，志贺菌是 快速和有力的MEK1激活物(图1C，道4-6)，但矛盾之处在于其不能诱导 下游的Erk的酶性活化(图1D，道5-7)。志贺菌通过改变Erk的空间定位或通过调节负责对Erk的关键性磷酸 化苏氨酸和酪氨酸残基进行双重去磷酸化的细胞磷酸酶活性，志贺菌能够 灭活Erk。在哺乳动物中，MAP激酶磷酸酶(MKP)是DSP，它们对多种 MAP激酶展现出底物偏好性并占据不同的亚细胞空间。因此，尽管MKP-3似乎仅在细胞浆中，但MKP-l和MKP-2定位于细胞核，使得Erkl/2以 其去磷酸化形式聚集于细胞核(Volmat et al., 2001)。评价志贺菌感染后的 Erk并将其与总Erk和活性Erk的定位进行对比活性的磷酸化形式全部移位至细胞核(图1E)。有趣的是，志贺菌感染却是 诱导Erk以其无活性的去磷酸化形式聚集于细胞核。存在志贺菌时进行 PMA刺激导致未修饰的Erk定位于细胞核，而细胞核仍然没有磷酸化的 Erk。在VP-菌株感染过程中没有发现这一效应。这些结果提示，当移位至细胞核内后，侵袭性志贺菌能够触发细胞核 内针对Erk的磷酸酶活性。哺乳动物MKP-1或2是细胞核内灭活Erk的可 能候选物，但它们是应答于各种刺激新合成的(Brondello et al.， 1997)。然 而，以放线菌酮处理阻断志贺菌感染后的蛋白质合成证实，志贺菌灭活 Erk不依赖于新蛋白质合成。根据这些结果，由侵袭性质粒编码的细菌蛋 白质效应物能够通过TTSS被注入细胞，诱导Erk在细胞核内的灭活。实施例3: a^F基因编码直接并双重去磷酸化Erk的细菌磷酸酶一旦接触上皮细胞表面，志贺菌TTSS装置活化且大约20种蛋白质通 过此分泌系统(secreton)而被分泌。细菌在37。C体外生长过程中，TTSS装 置具有弱活性并通过或^"Z)基因的灭活而去调节(deregulated) (Menard etal.， 1994)。由于多数哺乳动物中的Erk磷酸酶是可溶性酶，因此建立了一种鉴定 推定的细菌DSP的策略，该策略使用来自去调节的突变体菌株的细菌上清 液，该突变体菌株中^a^基因已经被灭活(z)^B2菌株)或者破坏，产生截 短形式的ipaB蛋白(^"万4菌株)(Mavris et al.， 200h)。使用商品化的磷酸 化Erk2-谷胱甘肽S转移酶(pErk2-GST)融合肽作为底物，分析来自这些突 变体菌株的上清液的磷酸酶活性。来自两种z》aB突变体的上清液均具有强烈去磷酸化pErk2-GST的作 用(图2A，比较第l-2道和3-4道)。这些结果显示，分泌型细菌蛋白能够 起到Erk磷酸酶的作用。灭活z》a j、 B、 C、和D基因(^ o45CZ)突变体 菌株)并不损害上清液对底物的去磷酸化(图2A，道6)，说明IpaA-D的蛋 白质没有参与这一过程。志贺菌蛋白质效应物的转录由受到MxiE控制的分泌活性调节，MxiE 是由侵袭性质粒编码的转录激活物，其属于AmC家族的转录调节物。 Mx正对于编码分泌型蛋白质的11种质粒基因的表达是必需的(Mavris et al.， 2002b)。有趣的是，^"B4mx/五双突变体菌株的上清液缺乏磷酸酶活性(图2A，道5)。这些结果说明，ll种受到MxiE转录调节的分泌型蛋白质中有 一种是磷酸酶。使用纯化的蛋白质，测试了这11种蛋白质中的3种，g卩OspG、 OspF 和IpaH的磷酸酶活性。纯化的OspF直接去磷酸化Erk2 (图2B)。使用针 对位于活化袢结构域的TEY序列中的磷酸化Thr183 (pT183)或磷酸化Tyr185 (pY185)残基的抗体来检测Erk中这些残基的特异性去磷酸化。OspF去磷酸 化Thr和Tyr残基(图2C，道2)。因此，OspF是双特异性磷酸酶。其磷酸 酶活性被酪氨酸磷酸酶抑制剂钒酸盐抑制(图2C，道3),但不被丝氨酸苏 氨酸磷酸酶抑制剂岗田酸抑制(图2C，道4)。为了确定OspF催化的去磷酸化作用的动力学参数，使用激酶MEK1 (图2D，道l)通过体外磷酸化以"P标记重组Erk2，以磷酸化特异性Erk2 抗体验证产生的pT^或pY^残基上被磷酸化的Erk2 (图2E，道1)。将底 物与OspF或作为对照的已知双特异性磷酸酶MKP1温育。通过SDS-PAGE/放射自显影揭示的底物凝胶迁移的增加以及Western印迹，证实两 种酶对Erk2的去磷酸化，强烈抑制磷酸Erk信号(图2D和2E，比较第1 道与第2和3道)。通过跟踪放射性无机磷酸的产生而确定动力学参数。图2F显示了典 型一组初始速率对重组pErk2浓度，pH8， 30。C，与MPK1相比。将数据 直接曲线符合于米曼氏方程式，所得到的Vmax、 Km、和keat分别为9.89 pMs"、 204 nM、和0.0001 s"。这些值与以MKP1得到的值(V,、 Km、和 kcat分别为6.01 pM s"、 229 nM、和0.0006 s")相似。因此，OspF催化的 Erk2去磷酸化作用的动力学参数与以哺乳动物DSP MKP1得到的值相当。 值得注意的是，OspF的一级氨基酸序列不含存在于所有DSP中的典范催 化活性位点序列His-Cys-Xaa5-Arg-(Ser/Thr)(综述请参见Zhang， 2002)。在 典范催化基序中，半胱氨酸(cys)残基与底物提供的磷酸形成共价键，因此 对于催化是必需的。组氨酸(His)在催化中也起到关键作用，这是因为其 咪唑环与Cys相互作用，并保持该残基在磷酸酶的P袢(P-loop)中的正确位 置(Kimetal.， 2001)。将OspF的保守性Cys (Cys88、 163、 *18Q)和His残基分别突变为丝氨酸 (Ser)和亮氨酸(Leu)，以探查其在催化位点的可能作用。将这些突变体的各 表达质粒转染至HeLa细胞内。OspF的Cys残基至Ser的三个突变(C88S、 C163S和C180S)无一影响该蛋白质在PMA刺激后双重去磷酸化 Erk的能力。类似地，172位His至Leu的突变导致保持磷酸酶活性(图 2G，道13-17)。相反，Hisl04残基单点突变为Leu (H104L)损害了 OspF 在体内去磷酸化Erk的能力(图2G，道8-12)。在平行实验中，以GST-融 合蛋白形式纯化的H104L突变体即便在高浓度也不能去磷酸化重组的磷酸 化Erk2底物(图2H，道7-11)。总之，这些结果说明OspF不是基于Cys的 PTP，且提示该磷酸酶的活性需要His104。DxDGS序列基序(基序Asp217-X-Asp219-Gly-Ser) (SEQ ID NO. 9)是在 OspF的C端结构域中鉴定的。该序列类似于在基于天冬氨酸的PTP中发 现的DxDG(T/V)保守性基序，其中第一个天冬氨酸在催化过程中经历金 属辅助性磷酸化，而第二个天冬氨酸作用为一般的酸(Collet et al.， 1998; 综述见Alonso et al.， 2004)。该类酶被已知在结构上模拟磷酸化天冬氨酸中 间体的氟化铍阴离子BeF3-抑制(Cho et al., 2001; Kamenski et al.， 2004; Yan etal., 1999)。类似地，OspF活性被多种磷酸类似物抑制，如正钒酸盐、氟 化铝、和氟化铍，提示存在催化性天冬氨酸残基(图21，道4-9)。但OspF 的作用呈金属非依赖性模式，这是因为其活性没有被EDTA阻断。此外， D217和D219这两个天冬氨酸残基保守性突变为天冬酰胺没有损害对 GST-Erk2底物的磷酸酶活性。因此，OspF的磷酸酶活性基于新的反应机 制，且OspF很可能代表一类新的氨酸磷酸酶。为了研究OspF在体内是否具有磷酸酶活性，以渐增量的编码myc标 记的OspF的质粒(这使得可免疫学检测的蛋白质呈剂量依赖性增加)转染 HeLa细胞，并以PMA (图3A)或TNF (图3B and C)刺激。myc标记的 OspF的表达阻止了内源性Erk (图3A)和p38 MAP激酶(图3B)的磷酸 化，但未阻止p46和p54JNK激酶(图3C)。构建0^F突变体菌株(cwpF菌株)，其中通过插入携带ospF的内部片 段的自杀质粒而造成基因表达破坏，灭活os;^基因。0^F突变体与野生 型菌株相比，在进入上皮细胞以及胞内菌从细胞到细胞的播散等方面没有 显示出任何差异。用作内对照的是以w; F反式互补的owF菌株 ((w卢pUC-OspF)。以突变体感染Caco 2细胞诱导Erk (图3D，道7-9)和p38 MAPK (图3E，道7-11)磷酸化，而与表达OspF的样品相比，p46和p54JNK激酶的磷酸化状态没有变化(图3F)。以HeLa细胞得到了类似的结 果。以OspF互补o^F突变体逆转了这一表型，导致Erk和p38MAP激酶 不被磷酸化(图3D和3E)。因此，OspF在体内展现出双特异性，选择性灭 活不同的MAP激酶。
通过在纯化的磷酸化MAP激酶蛋白质上分析磷酸酶活性进一步研究 了OspF的底物特异性。OspF直接去磷酸化Erk和p38 MAP激酶，但不同 于MKP1的是，其不能去磷酸化JNK1 (图3G)。因此，对于灭活因细菌进 入而活化的MAPK亚组而言，OspF是必需的。
图1E提示MAP激酶在细胞核内被去磷酸化。研究了细菌攻击后 OspF在细胞内的分布。使用抗OspF抗体进行间接免疫荧光。该抗体未与 任何细胞内蛋白质发生交叉反应，其与细胞内过表达的OspF发生强烈的 免疫反应。以WT志贺菌菌株或oy/ F菌株(作为对照)感染HeLa细胞。在 这些细胞中，感染WT者OspF在细胞核内聚集15分钟，而在感染oy; F 缺陷型菌株者则没有观察到信号(图3H)。以抗OspF和抗核孔复合体蛋白 (NPC)抗体进行双标记证实，OspF在志贺菌感染过程中定位于核内(图 31)。因此，OspF的核内定位与志贺菌感染后所观察到的Erk以其去磷酸 化形式聚集于核内是一致的(图1E)。
实施例4:志贺菌感染上皮细胞过程中OspF磷酸酶阻抑免疫基因的基因转 录
为了研究OspF是否调变志贺菌诱导的上皮细胞内的转录应答，使用 Caco 2细胞进行转录组分析(transcriptome analysis)，所述细胞已经以 WT、 w/^突变体(os;pF菌株)、或反式互补菌株(owF/pUC-OspF)志贺菌感 染了 2小时。每种菌株进行两个独立的微阵列杂交实验。总共鉴定到46 种基因的转录在感染a^F菌株(相对于WT)后被上调，上调的系数大于 1.5 (图4)。感染反式互补菌株后仅3种基因被上调，这说明在突变体菌株 中所观察到的上调反映了缺乏OspF蛋白表达的情况。上调的基因主要包 括 一些经典的MAPK依赖性耙基因，它们参与细胞存活(BCL2家族成 员)，和一些立即早期(IE)基因如编码早期生长因子和AP-1蛋白的基因， 以及一些NF-kB依赖性细胞因子如CCL-20。受到调变的基因表达的分级 聚类见图4。有相当大量的涉及Erk或p38过度活化的炎性疾病或癌症疾病。在慢性炎性疾病如类风湿性关节炎(RA)和炎性肠病(IBD) (Waetzig， 2002)中，p38丝裂原活化的蛋白(MAP)激酶在IL-1|3和TNFa的产生中发 挥关键作用，IL-lp和TNFa是被明确鉴定为这些疾病的治疗靶向的细胞因 子(Miwatashi, 2005; Peifer， 2006)。
对于编码趋化因子的基因，缺乏OspF使得志贺菌诱导的mRNA表达 谱类似于由WT菌株诱导的表达谱，但总体表达水平升高。这种升高对于 树突状细胞化学引诱物趋化因子CCL20和IL-8基因特别重要，提示OspF 在调变炎性趋化因子的表达中发挥作用。RT-PCR分析证实了这些发现。 这些结果说明，与野生型菌株相比，o乎F突变体强烈上调c-fos和IL-8 mRNA表达(图5A)。对于这些基因，也观察到了蛋白质水平的上调。 Western印迹分析发现，在感染0^F突变体菌株后的早期时间点，c-fos蛋 白的聚集明显升高，但感染WT菌株后则不是这样(图5B，比较第2-3道 和6-7道)，这种表型被反式互补菌株完全逆转(图5B，道10-13)。鉴于 IL-8在细菌性痢疾发病中具有重要作用(Sansonetti et al.， 1999)，监测了 IL-8 mRNA的表达。突变体ow尸菌株感染使得IL-8编码mRNA明显上调 (图5A)。类似地，感染细菌后5小时，与WT和反式互补菌株相比，IL-8 分泌水平应答于os;^菌株而明显增强(图5C)。
总之，这些结果显示，OspF选择性阻抑一组主要参与炎症和天然免疫 应答的基因。通过耙向上皮细胞中的Erkl/2和p38信号途径，志贺菌能够 控制上皮细胞中的促炎性过程。
实施例5: OspF磷酸酶通过灭活MAPK损害志贺菌感染细胞中的组蛋白 H3磷酸化
除了经典的MAPK依赖性耙基因，OspF还阻抑一些NF-kB依赖性趋 化因子基因例如IL-8的表达。IL-8启动子含有该基因表达所必需的NF-kB 结合位点(Hoffinann et al.， 2002)。因此，本发明人研究了 OspF是否干扰 NF-kB信号途径。以Caco 2核提取物进行电迁移率转变分析(EMSA)发 现，WT和os; F菌株在感染后1小时均诱导相似的核NF-kB结合活性(图 5D)。以抗p50和p65抗体进行的超变动分析发现，两种志贺菌菌株均产 生典型的p50-p65 NF-kB二聚体(图5E)。此外，NF-kB转录活性本身未受 影响，这是因为lKB-a(—种典型的NF-KB依赖性基因)的转录水平和翻译水平均被WT和ospF菌株以类似程度上调(图5F)。最后，在Caco 2细胞 中过表达OspF没有损害TNF-a诱导的NF-kB受体构建体的活化。这些结 果说明，OspF对志贺菌诱导的IKK-NF-kb途径活化没有损害。
本发明人研究了 OspF介导的MAPK抑制如何导致选择性一组NF-kB 应答基因的阻抑。MAPK对于遮蔽一亚组的细胞因子和趋化因子基因(包 括IL-8)的NF-kB结合位点的染色质结构的去包装是必需的(Saccani et al., 2002)。的确，组蛋白的共价修饰如MAPK诱导的组蛋白H3的SerlO磷酸 化标记出了用于NF-kB募集的启动子(Id.)。此外，这种组蛋白修饰与IE 基因相关联(Clayton et al.， 2000)。如上所述，OspF阻抑了 IE基因的诱 导。通过抑制负责组蛋白H3在Ser 10磷酸化(H3 pS10)的主要MAPK，即 p38和Erk， OspF可发挥转录阻抑物的作用。
为验证这一假设，以WT志贺菌或a^F突变体菌株感染HeLa细胞， 并使用抗磷酸化组蛋白H3 Ser 10抗体进行免疫荧光(IF)(图6A)。 WT菌 株不能触发组蛋白H3在Ser 10磷酸化(H3 pS10)，而0^尸菌株诱导了强 烈的一过性H3 pS10信号(图6A)。使用Caco 2细胞观察到了类似的结 果。为了避免检测的是有丝分裂H3 pS10，采用双重胸苷阻断使得HeLa 细胞停滞于S期。以0^F菌株感染细胞时，Western印迹观察到H3 S10 的磷酸化(图6B)。为了验证感染WT菌株后缺乏H3 pS10信号并非是由于 可能遮蔽表位的修饰引起的，测试了对双重修饰具有特异性的抗体。如图 5B所示，针对携带甲基化K9和磷酸化Ser10的组蛋白H3 (H3 metK9-pS10)以及携带磷酸化Serl0和乙酰化K14的组蛋白H3 (H3pS10/Ac-K14) 的抗体得到了与抗H3 pS10抗体相同的结果。
使用编码myc标记的OspF的质粒在HeLa细胞中过表达OspF。 OspF 过表达并未损害去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素(trichostatin)诱导K14过度 乙酰化的能力。免疫荧光显示OspF主要定位于细胞核并有效防止岗田酸 对H3 pS10的诱导(图6C)。因此，磷酸乙酰化组蛋白H3水平的变化很可 能反映了 OspF降低Serl0磷酸化水平的单一能力。
总之，这些结果说明OspF防止志贺菌感染过程中组蛋白H3 S10的磷 酸化。为鉴定该过程所涉及的分子机制，本发明人测定了 OspF是否直接 去磷酸化H3。将纯化的OspF与纯化自小牛胸腺的组蛋白H3或各种模拟 携带mctK9-pS10或pS10修饰的组蛋白H3尾部的肽相温育(图6D和6E)。这些结果提示，不同于X磷酸酶，OspF不直接去磷酸化这些底物， 即使将酶浓度升高100倍也是如此。有趣的是，当p38和Erk的活化被 U0126和SB 203180 (两种特异性的Erk和p38激酶抑制剂)阻断时， 菌株诱导的H3pS10信号被完全抑制(图6F)。这一发现说明，这两种激酶 负责a^F菌株感染后所观察到的H3 pS10，并提示OspF介导的针对 MAPK的DSP活性在阻断志贺菌诱导的组蛋白H3磷酸化中发挥关键作 用。
组蛋白H3的柔性N端尾部在SerlO附近也受到其他共价修饰。这些 修饰包括与转录活化相关的Lys 14 (K14)乙酰化以及已知作为阻抑标志的 Lys 9 (K9)甲基化。为了验证感染志贺菌WT菌株后缺乏H3 pS10并非是由 于可能遮蔽表位的修饰引起的，测试了对双重修饰具有特异性的抗体。如 图6B所示，针对携带甲基化K9和磷酸化SerlO的组蛋白H3尾部(H3 metK9-pS10)以及携带磷酸化SerlO和乙酰化K14的组蛋白H3尾部 (H3pS10/Ac-K14)的抗体得到了与抗磷酸化组蛋白H3 Ser IO抗体相同的结 果。
这些结果证实OspF损害志贺菌诱导的组蛋白H3 S10磷酸化。其也提 示OspF防止在Serl0-K14形成磷酸乙酰化组蛋白H3。不过，磷酸乙酰化 组蛋白H3水平的变化很可能反映了 OspF降低Ser IO磷酸化水平的能力， 这是因为过表达OspF并未损害去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素诱导K14过 度乙酰化的能力(图6G)。这些结果说明OspF选择性靶向组蛋白H3 Ser 10。
实施例6: OspF以基因选择性方式抑制组蛋白H3磷酸化启动子的形成并 损害NF-kB和RNA聚合酶II在IL-8启动子位点的募集
为了研究OspF是否在IL-8启动子附近改变组蛋白H3磷酸化，以抗 H3 metK9-pS10抗体或作为对照的无关同型IgG进行染色质免疫沉淀 (ChIP)分析。超声处理的染色质的平均大小为500 bp以便分析PCR产物 (150bp)(图7A)，通过实时定量PCR分析数据。
作为对照，使用了 CD44基因和编码核糖体蛋白大亚基P0 (ribosomal protein large P0， RLPO)的基因。这些基因在Caco 2细胞顺利转录，但与 Erk或p38 MAPK信号途径无关。RT-PCR分析显示，感染WT和ospF菌株后CD44 mRNA表达水平保持不变(图5A)。本发明人还检查了编码核糖 体蛋白大亚基P0 (RLP0)的基因。RT-PCR分析提示，细菌攻击以OspF非 依赖性方式上调RLP0 mRNA表达，这为这些实验提供了有趣的阳性对照 (图5A)。作为不被OspF阻抑的NF-kb应答基因的典型成员，检査了 IkB-a基因。此前报道该基因在树突状细胞中以MAPK非依赖性方式经历H3 磷酸化(Saccani et al., 2002)。如上所述，该基因在转录和翻译水平均被 WT和0^F菌株以类似方式上调(图5F)。
与IF和Western印迹所得结果(图6A和6B) —致，Caco 2细胞感染 os; F菌株导致IL-8启动子上的组蛋白H3在SerlO的磷酸化(H3pS10)水平 在30分钟内升高大约400倍，而WT菌株几乎没有影响(图7B，左侧)。 因此，OspF强烈阻抑在IL-8处形成H3pS10。有趣的是，OspF并未在 CD44和IkB-cx扩增子上改变H3磷酸化(图7D和7F)。此外，OspF的存在 从未影响由这两种细菌攻击诱导的磷酸化组蛋白H3 (与RLPO启动子接触) 的牢固募集(图7E)。这些结果提示，OspF对组蛋白H3的影响具有基因特 异性。
通过将细菌效应物直接空间定位于靶启动子有可能更加容易地实现这 种基因特异性。为了探讨这种可能性，以编码WTOspF、无催化活性的 OspF H104L或作为对照的C端缺失OspF (1-221)的最后30个氨基酸的突 变体(其不能定位于细胞核)的质粒转染HeLa细胞(图7G)。这些HeLa细 胞处理后用于CMP分析，使用的是抗OspF抗体。
从酵母和人的系统得到的新证据提示， 一旦被活化，MAPK即定位于 核内以稳定结合于载有其靶基因的染色质(Alepuz, 2001， Pokholok， 2006)， 使得该激酶活性有可能起始信号途径，引起染色质水平的基因特异性修 饰。由于OspF作为磷酸酶在细胞核内对MAPK进行去磷酸化，相比活化 能够将OspF靶向选定的启动子，以打断导致H3磷酸化的MAP激酶信号 级联。
为研究MAPK是否在IL-8启动子附近诱导H3pS10，处理表达编码 WT w/^、或作为对照的C端缺失as^F (1-221)的最后30个氨基酸的突变 体(其不能定位于细胞核)的质粒的HeLa细胞(图7G)，用于使用抗OspF 抗体进行染色质免疫沉淀(ChIP)分析，并通过实时定量PCR分析OspF在 IL-8启动子处的富集。作为额外的对照，还在这一转录分析中检查了多种不被OspF阻抑的基因IkB-cx、 CD44和编码核糖体蛋白大亚基P0 (RLP0) 的基因，RLPO基因由志贺菌攻击以OspF非依赖性方式转录诱导(图 5A)。
尽管免疫荧光提示OspF在核内明显聚集(图7G)，但在未刺激的细胞 中IL-8启动子处没有可检测到的OspF (图7H)。与此不同，TNF-ot刺激诱 导OspF —过性募集于IL-8启动子，但在IkB-ou RLPO或CD44启动子则 没有募集。在未剌激的细胞中，在IL-8启动子处没有检测到信号(图 7H)。这一结果提示炎性刺激能够潜在地将该效应物驱动至选定的启动子 处，这为在启动子水平诱导位点特异性下调MAPK诱导的H3 S10磷酸化 提供了有吸引力的机制。因此，细胞刺激将OspF靶向选定的启动子，这 为诱导对特定基因座进行位点特异性后天修饰(epigenetic modifications)提 供了有吸引力的机制。
已有模型提示，MAPK激酶活化对H3的磷酸化是暴露特定基于的 NF-kB结合位点的先决条件(Muegge, 2002)。对这一模型构成支持的是， 以药理学MAPK抑制剂处理细胞降低了 p65 NF-kB亚基在IL-8启动子处 的募集(Saccani et al., 2002)。 OspF对p38和Erk的高选择性DSP活性允许 直接对它们在这一过程中的作用进行评估。
使用针对NF-kB的p65亚基的抗体进行Chip分析。使用CD44扩增 子作为阴性对照，这是因为该基因不含有任何NF-kB结合位点。如图7B (右侧)所示，0^F的灭活明显促进了志贺菌诱导的p65在IL-8启动子处的 募集，而在CD44启动子则没有检测到信号。由于p65亚基通过募集 RNAPII活化转录(Xia et al.， 2004)，因此使用免疫沉淀总RNA聚合酶II的 抗体进行ChIP分析。正如所期望的那样，该实验显示，缺乏OspF时， RNA聚合酶II与IL-8启动子的结合增强(图7C)。因此，OspF改变了主要 转录成分在选定启动子处的募集。
实施例7: OspF磷酸酶抑制IL-12的产生
通过比较感染携带侵袭性质粒的侵袭性菌株(INV+)和非侵袭性无质粒 的菌株(INV-)后获得的模式资料来分析弗氏志贺菌感染诱导的细胞因子/趋 化因子网络。使用该肺部感染的鼠模型是因为其是分析志贺菌感染后特异 性宿主免疫应答的唯一有效模型。感染INV-后诱导了 Thl型网络(IL-12、il-18、 IFN-y、 ccl9、 cclio、 ccl13、和ccl4)。相反，感染inv+后 诱导了 Th2/Trl模式(IL-IO、 CCL1、 CCL24、和CCL2)。所观察到的区别 并不是因感染所使用的细菌剂量不同而引起的，而是取决于是否存在侵袭 性质粒。这些结果说明，侵袭性志贺菌抑制IL-12/IFN-y的产生。
树突状细胞(DC)是IL-12的主要来源之一，志贺菌在感染后早期时间 点即靶向DC。实际上，自感染INV+的小鼠回收的DC不产生IL-12,而 自感染INV-的小鼠回收的DC则产生(图8)。这一假设在于，该细菌为了 建立其感染过程，创建了一个没有IFN-y的适宜的局部环境，而IFN-y是清 除初次感染所必需的，因此对志贺菌也是有害的(LeBarillecK.，etal.)。不 同于其他感染性模型(McGuirk， 2002 and Sing, 2002)，在IL-10敲除(KO) 小鼠中，该细胞因子在抑制IL-12/IFN-y途径中并不发挥关键作用，因为在 感染INV+的IL-10 KO小鼠中这些细胞因子的产生仍然受到抑制(图9)。 这一结果提示有一或多种致病因子参与了这种抑制作用。
这些细菌效应物的某些是通过III型分泌装置注入宿主细胞的。使用 不同的细菌突变体已经表明，参与免疫调变的细菌效应物是通过III型分 泌装置分泌的效应物。最后，OspF这一通过III型分泌的细菌效应物负责 控制IL-12的产生(图10)。
实施例8: OspF磷酸酶对建立保护性免疫应答的影响
研究了与志贺菌感染有关的免疫调变对诱导适应性免疫的影响。对如 下三组进行分析第一组感染了 M90T菌株，第二组感染了 ow尸菌株， 而第三组感染了水(对照)。每只小鼠接种108个细菌，3周后给每只小鼠以 107个细菌加强。加强后8周以致死剂量的细菌攻击小鼠(每只小鼠5 x 108 个细菌)并监测存活情况。如图11所示，面对攻击，接种OwF突变体的 小鼠相对于接种INV+的小鼠得到了更加有效的保护。
实施例9: OspF在体内是多形核白细胞募集的阻抑物
OspF影响一亚组免疫基因的表达。因此，采用兔的结扎回肠袢感染模 型来硏究这种调节在体内的重要性。以WT菌株、os/^突变体、或作为对 照的反式互补菌株(ospF/pUC-OspF)感染兔的肠拌8小时。苏木精染色显 示，相对于WT菌株，os^突变体引起更加严重的粘膜病变，小肠绒毛縮短涨大更加明显，且上皮破坏的区域更加广泛，这通常相当于脓肿。互补
突变体恢复了与WT菌株相似的表型。
在免疫标记实验中，以抗弗氏志贺菌5a LPS抗血清对细菌进行染色 (图14 A-D)，并以抗NP5抗血清对多形核白细胞(PMN)染色(图14E-G)， 该抗微生物肽在这些细胞中强烈表达。LPS染色表明，WT细菌仍明显定 位于上皮和紧邻的上皮下区域的脓肿中。这些脓肿破坏了上皮层，并通常 性定位于小肠绒毛结构形成的深切迹的底部(图14A)。此外，常见到有限 的迁移炎性细胞渗出，自这些溃疡病变处流出(箭头，图14A)。 NP5染色 确认感染区域存在PMN，并显示在粘膜固有层、水肿的粘膜下组织和肠 腔中有一定水平的PMN渗入(图14E)。
ospF突变体感染组织的抗LPS染色显示显著不同的感染模式，表现为 大量细菌渗入粘膜固有层，远超过WT感染所见的浅表溃疡(箭头，图 14C)。与此平行的是，观察到大量的肠腔内炎性细胞渗出，其大部分与细 菌相关(箭头，图14D)。 NP5染色确认粘膜固有层有广泛的PMN渗入， 且它们大量渗出至肠腔中(图14F)。这两种染色方法表明，反式互补型突 变体恢复了野生型的表型(图14B,箭头，和14G)。总之，这些实验表 明，OspF是志贺菌感染组织中PMN募集的主要负调节物。
结论
动物和植物的革兰氏阴性病原体利用专门的分泌系统将效应物蛋白移 位至宿主细胞内。这些效应物有少量是酪氨酸磷酸酶来自假结核耶尔森 氏菌(yew/m'a pewc/oft^en^/o^)的YopH阻抑肌动蛋白的聚合作用 (Andersson et al.， 1996)，来自鼠伤寒沙门菌的SptP破坏肌动蛋白骨架(Fu and Galan， 1998)，和来自丁香假单胞菌的HopPtoD2是植物中的程序性细 胞死亡的抑制物(Espinosa et al., 2003)。总之，这些效应物对磷酸化Tyr残 基展现出高度的选择性(Kenndly， 2001)，来自非致病性蓝细菌普通念珠藻 的IphP蛋白是例外，其在体外既水解磷酸化Ser残基也水解磷酸化Tyr残 基(Potts et al.， 1993)。 IphP由染色体编码，且可能定位于周质。其与哺乳 动物DSP具有结构上的相似性，但目前其功能未知(Id.)。相反，OspF由 220 kb的侵袭性质粒编码，该质粒编码志贺菌的侵袭性表型。OspF被移位 至耙真核细胞内，并在此被表征为参与细菌致病性的第一种DSP。有趣的是，OspF不含有所有其他DSP中均存在的典范催化活性序列 His-Cys-Xaa5-Arg-(Ser/Thr)，这不支持该蛋白质来源于真核细胞。不过， OspF与来自其他变形细菌的推定的致病蛋白质之间的显著同源性(图13)提 示它们具有共同的始祖，是获得性的并保持下来作为这些细菌的选择优 势。目前，已经鉴定了四类蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)，均是基于它们的催 化结构域的氨基酸序列而鉴定的(综述请参见Alonso et al.， 2004)。这些组 中有3种是基于半胱氨酸的PTP,并包括酪氨酸特异性传统PTP，如 YopH、 SptP、 HopPtoD2以及DSP。 OspF不是这些类型的成员，因为我们 已经对其所有的半胱氨酸残基进行了突变，但发现这对其催化活性没有影 响。
第四类是基于天冬氨酸的PTP，包括RNA聚合酶II CTD磷酸酶和来 自a&e"f家族的转录调节物(综述请参见Rebay et al.， 2005)。这些 PTP具有保守性的DxDG(TAO催化基序，它们是严格的镁依赖性酶，且被 氯化铍抑制(Cho et al., 2001和Kamenski et al.， 2004)。 OspF的活性也被氯 化铍抑制，提示存在催化性天冬氨酸残基。此外，OspF含有类似于 DxDG(T/V)基序的序列。但其催化活性不能被归于此序列。总之，这些结 果提示OspF不是典型的基于天冬氨酸的PTP，且可定义一类新的酪氨酸 磷酸酶。
OspF对灭活Erk和p38 MAP激酶具极高选择性，转录分析表明其阻 抑一小组，但却是重要的一小组基因(包括正基因和一些NF-KB应答基因 如IL-8)的表达。这体现在，体内实验显示，与野生型志贺菌相比，os/7尸 突变体产生压倒性的PMN粘膜侵润并大量跨过上皮迁移至肠腔内。丰富 的证据表明，在实验性志贺菌感染过程中，IL-8是PMN粘膜交通的主要 效应物(Sansonetti et al., 1999)，且感染志贺菌的小鼠中缺乏肠道炎症很大 程度上是因为鼠系缺乏该趋化因子(Singer and Sansonetti， 2004)。最大的可 能性是，注入的效应物如OspF专门用于非常局限的、但却非常重要的生 理学功能，各种所注入的效应物如OspF、 OspG (Kim et al.， 2005)、及其他 等的相加效应，导致对宿主的转录性天然应答作出非常特异性的调节。
OspF灭活后范围有限的被刺激的启动子提示该细菌效应物并不控制所 有可能被MAPK途径活化的基因。这并非是出乎预料的，因为在大多数情 况下诱导型启动子能够应答于由促炎性刺激活化的额外的信号转导途径。不过，OspF的特异性所带来的问题是该细菌磷酸酶如何能够确保阻抑选择 性的一组耙基因，且更具体而言， 一亚组的NF-KB应答基因。最近认为， 由于存在不允许NF-kB募集的特异性染色质构型，因此可以解释如何防止 NF-kB与若干NF-kB应答基因如IL-8结合(综述请参见Natoli et al.， 2005)。对于这些基因，MAPK依赖性组蛋白修饰，例如H3在SerlO的磷 酸化，促进启动子位点处的染色质去致密化，由此允许NF-kB成功募集 (Muegge, 2002; Saccani et al.， 2002)。本发明人研究了 OspF对组蛋白H3磷 酸化状态的功能性影响，并发现OspF防止组蛋白H3在SerlO的磷酸化。 这种影响不是随机分布的，而是基因特异性的。通过细菌效应物直接空间 定位于选定的靶启动子，这样的调节水平可能更加易于实现。染色质免疫 沉淀显示，促炎性刺激物如TNF-a对细胞的刺激直接诱导效应物定位于选 定的启动子。
与OspF出现于启动子位点处相一致的是，先前在酵母和人进行的研 究发现，MAPKp38被直接募集至靶启动子处，在该处其起始信号途径， 导致影响转录的位点特异性修饰(Alepuz et al.， 2001; Simone et al.， 2004; Edmunds and Mahedevan, 2004)。 OspG的基因募集可诱导MAPK在细胞核 内的相关启动子位点处发生去磷酸化，活化蛋白激酶级联，导致局部的 H3磷酸化。对一些启动子的研究揭示，仅在那些受到OspF调节的基因才 观察到不适当的H3 SerlO磷酸化。总之，这些结果提示，OspF介导的选 择性转录控制的一个重要机制是在启动子水平位点特异性下调MAPK诱导 的H3 SerlO磷酸化。显然，OspF也有可能具有其他的局部靶，例如启动 子结合型转录因子。就此而言，无催化活性的OspF突变体与WT OspF相 比能够更加稳定地结合于IL-8启动子(至少2小时)，这提示OspF可靶向 其自身的细胞核锚(nuclear anchOT)而导致其自身与启动子位点处的维系变 得不稳定。
病原体在感染早期对粘膜表面的天然免疫应答特别是对炎症的调变， 对于建立感染过程以及随后诱导的适应性免疫的性质而言均是重要的先决 条件。在此给出的结果表明，OspF诱导了调节特定一组基因所需的精确的 后天修饰，特别是其中的IL-8基因，其控制炎性细胞例如PMN通过肠道 的粘膜固有层和上皮层。OspF还下调其他重要的基因，例如CCL-20,后 者的功能是作为抗微生物肽(Hoover et al.， 2002)以及免疫细胞的化学引诱物(Dieu et al.， 1998)。这样，OspF可通过阻断树突状细胞在感染部位的募集 而提高侵入的志贺菌的生存力并抑制适应性免疫应答。不过，以上假设并 没有考虑这样一个矛盾的现象，即OspF突变体在整个上皮下组织(即粘膜 固有层)中的播散要比WT志贺菌更加广泛。鉴于这一现象，志贺菌在肠道 粘膜中的感染过程，如体外和体内模型所证实的那样(Perdomo et al., 1994a; Perdomo et al., 1994b)， PMN向肠腔的迁移造成了上皮细胞屏障的破裂， 促进了细菌进入上皮下组织。在OspF突变体那方面，与WT菌株相比， 过度的迁移显然能够增加对粘膜侵入。
出于调节宿主免疫应答的需求，志贺菌已经选择了特异性的袭击方 式，以外科手术的精确性打击宿主的免疫系统。这一方式必须有精致复杂 的策略，例如OspF通过灭活一组重要的免疫基因所必需的基因特异性后 天修饰而对转录应答重新编程。这种适应性是微生物病原体与其宿主直接 的精致相互作用的范例。
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权利要求
1.治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，其包括给所述哺乳动物施用包含OspF或模拟OspF活性的物质的药物组合物。
2. 权利要求l的方法，其中所述癌症选自结肠癌和胰腺癌。
3. 权利要求l的方法，其中所述哺乳动物是人。
4. 包含药物组合物的抗癌治疗，所述药物组合物包含OspF或模拟 OspF活性的物质。
5. 筛选用于调变细胞的OspF活性的化合物的方法，其包括(A) 将化合物添加至培养的细胞中；(B) 温育所述细胞；(C) 检测细胞内的一或多种OspF蛋白调节活性；(D) 确定哪些化合物改变细胞内的所述一或多种OspF蛋白调节活 性；和(E) 选择调变OspF活性的化合物。
6. 权利要求5的方法，其中所述蛋白调节活性选自调节AP-l、 CREB、 RPA p32 (STAT激活物)、BCL2相关性抗凋亡蛋白、和主要促炎 性基因如CCL20、 IL-8、和IL-12的蛋白质表达和/或活性。
7. 权利要求5的方法，其中所述细胞是HeLa细胞、Caco 2细胞、 或免疫系统的细胞。
8. 筛选模拟OspF活性的化合物的方法，其包括(A) 将化合物添加至培养的细胞中；(B) 温育所述细胞；(C) 检测细胞内的一或多种OspF蛋白调节活性；(D) 比较所述化合物的蛋白调节活性和OspF的蛋白调节活性；和(E) 鉴定模拟OspF活性的化合物。
9. 权利要求8的方法，其中所述蛋白调节活性选自调节AP-l、 CREB、 RPA p32 (STAT激活物)、BCL2相关性抗凋亡蛋白、和主要促炎 性基因如CCL20、 IL-8、和IL-12的蛋白质表达和/或活性。
10. 权利要求8的方法，其中所述细胞是HeLa细胞、Caco2细胞、 或免疫系统的细胞。
11. 治疗或预防哺乳动物的炎性疾病的方法，其包括给所述哺乳动物施用包含OspF或模拟OspF活性的物质的组合物。
12. 权利要求ll的方法，其中所述哺乳动物是人。
13. 治疗或预防哺乳动物的移植相关性疾病的方法，其包括给所述 哺乳动物施用包含OspF或模拟OspF活性的物质的组合物。
14. 权利要求13的方法，其中所述哺乳动物是人。
15. 药物组合物，其包含OspF或模拟OspF活性的物质。
16. 权利要求15的药物组合物，其中所述组合物是佐剂。
17. 权利要求15的药物组合物，其中所述组合物还包含提高OspF 活性的化合物。
18. 调节免疫应答的方法，其包括给有需要的对象施用有效剂量的 权利要求15的药物组合物。
19. 弗氏志贺菌(幼/ge〃ayfemen')菌株，其中的0^ F基因是灭活的。
20. 权利要求19的菌株，所述菌株保藏于CNCM，保藏号为CNCM 1-3480。
21. 表达具有myc标记物的OspF的质粒，所述质粒保藏于 CNCM，保藏号为CNCM1-3496。
22. —种疫苗，其包含权利要求19的菌株和药用可接受载体。
23. 治疗或预防志贺菌感染引起的痢疾的方法，其包括给有需要的 患者接种权利要求19的菌株。
24. 权利要求23的方法，其中所述弗氏志贺菌是保藏于CNCM的菌 株，保藏号为CNCM 1-3480。
25. 治疗或预防志贺菌感染的方法，其包括给有需要的患者施用降 低OspF活性的化合物。
26. 模拟OspF的蛋白调节活性的物质，其中所述蛋白调节活性选自 调节AP-1、 CREB、 RPAp32 (STAT激活物)、BCL2相关性抗凋亡蛋白、 和主要促炎性基因如CCL20、 IL-8、和IL-12的蛋白质表达和/或活性。
27. 权利要求26的物质，其中所述物质是蛋白质。
28. 权利要求26的物质，其中所述物质是化学制品。
29. 权利要求11、 13或18的方法，其中所述药物组合物还包含提 高OspF活性的化合物。
全文摘要
弗氏志贺菌的OspF基因编码一种磷酸酶，其是新一类磷酸酶的成员。该OspF磷酸酶通过直接修饰蛋白质或下调转录而抑制多种蛋白质的活性。这些蛋白质包括MAP激酶、IL-8、CCL20、IL-12、AP1、CREB、RPA p32、和BCL2相关蛋白质。提供了利用OspF磷酸酶治疗疾病的方法、用于鉴定调变OspF磷酸酶的活性的药剂的方法、用于鉴定模拟OspF磷酸酶的活性的药剂的方法、和包含OspF磷酸酶的免疫原性组合物。还提供了含有灭活的OspF基因的弗氏志贺菌菌株。
文档编号A61P31/04GK101309700SQ200680042671
公开日2008年11月19日 申请日期2006年9月15日 优先权日2005年9月15日
发明者A·法利潘, C·帕尔索, K·董昱, L·阿尔比布, P·圣索内蒂 申请人:巴斯德研究院;国家健康与医学研究院