专利名称：一种培养基及其应用与赖氨酸摇瓶发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种特别适用于赖氨酸摇瓶发酵的培养基及其在赖氨酸摇瓶发酵中的应用以及使用该培养基进行赖氨酸摇瓶发酵的方法。
背景技术：
在赖氨酸发酵过程中，随着营养物质的消耗，发酵液pH值会不断下降，因此需要定时添加氨水或液氨来控制PH值以保证菌种的正常生长代谢，获得高含量的赖氨酸。尤其在进行赖氨酸的摇瓶发酵以获得赖氨酸产量高的菌株时，目前一般通过人工定时取样检测pH值并滴加氨水或液氨来调节pH值。但是人工调节pH值不好把握分寸，每次添加氨水或液氨至少需要进行2次pH值的测定，调节PH值耗费的时间较长且很容易添加过量，从而影响发酵结果。而且频繁取样检测会加大染菌的几率。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种培养基及其在赖氨酸摇瓶发酵中的应用以及使用该培养基进行赖氨酸摇瓶发酵的方法。为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种培养基，该培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有指示剂，所述指示剂的变色pH范围为5. 5-8。另一方面,本发明提供一种上述培养基在赖氨酸摇瓶发酵中的应用。再一方面，本发明提供一种赖氨酸摇瓶发酵方法，该方法包括将赖氨酸发酵菌种接种到培养基中进行摇瓶发酵，其特征在于，所述培养基为上述培养基。通过上述技术方案，操作人员不需要进行取样检测pH值即可以直接根据培养基的颜色变化确定补加氨水或液氨的时间和加量，简化了发酵操作过程，缩短了调节pH值耗费的时间，降低了操作人员的劳动强度，进而降低了染菌几率。另外，添加的指示剂不会对发酵产生负面影响。因此，使用本发明的培养基进行赖氨酸摇瓶发酵时，发酵的稳定性明显增强。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
具体实施例方式以下对本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明中，术语“波美度”是表示溶液浓度的一种方法，是通过波美比重计检测溶液得到的度数；“发酵液”是指接种了微生物菌种的液体发酵培养基，经过一段时间的培养后所得产物；“指示剂的变色pH范围”指的是指示剂的变色pH点所在的范围。本发明的培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有指示齐U，所述指示剂的变色pH范围为5. 5-8。
本领域技术人员所公知的是指示剂一般以溶液的形式使用，可以直接商购获得，也可以购买粉末状产品再配制成溶液使用，且配制时使用的溶剂和配制方法为常规试剂与方法，例如，中性红一般以0. 1-0. 3重量％浓度的溶液形式使用，配制方法包括先将0. 1-0. 3克中性红溶于60ml浓度为100%的乙醇中，再加水至100ml。根据本发明，相对于每升培养基，所述指示剂的添加量优选为0. 002-0. 012克。当指示剂的添加量在上述优选范围内时，显色明显且不会对赖氨酸发酵产生影响。需要说明的是，本发明中，指示剂的添加量以指示剂的干重计，即当所述指示剂以溶液形式使用时，指示剂的添加量不包括其中溶剂的量。根据本发明，只要所述指示剂的变色pH范围在上述范围内即可实现本发明的目 的，优选地，所述指示剂的变色pH范围为6. 5-8。优选地，所述指示剂为中性红、溴百里酚蓝、酚红、苯酚红和石蕊中的一种。根据本发明，所述培养基可以作为种子培养基，也可以作为发酵培养基，所述种子培养基与发酵培养基可以相同或不同。根据本发明，只要往培养基中添加指示剂即可实现本发明的目的，对培养基的其他成分(碳源、氮源和无机盐)无特殊要求，可以采用本领域常规使用的物质，例如，可以用淀粉质原料糖化清液、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵、苏氨酸和蛋氨酸等配制种子培养基。根据本发明，每升种子培养基中各原料的用量可以在很大范围内改变，优选情况下，相对于每升种子培养基，淀粉质原料糖化清液的用量可以为30-40克，玉米浆(干重为20-50重量％)的用量可以为70-90克，磷酸氢二钾的用量可以为0. 5-1. 5克，硫酸镁的用量可以为0. 4-1. I克,硫酸铵的用量可以为5-15克,苏氨酸的用量可以为0. 1-0. 6克,蛋氨酸的用量可以为0. 1-0. 3克。可以用淀粉质原料糖化清液、糖蜜、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制发酵培养基。根据本发明，每升发酵培养基中各原料的用量可以在很大范围内改变，优选情况下，相对于每升发酵培养基，淀粉质原料糖化清液的用量可以为40-60克，糖蜜的用量可以为30-50克，玉米浆(干重为20-50重量％)的用量可以为20-40克，硫酸铵的用量可以为20-40克，磷酸氢二钾的用量可以为0. 5-1. 5克，硫酸镁的用量可以为0. 4-0. 6克,苏氨酸的用量可以为0. 1-0. 3克,蛋氨酸的用量可以为0. 1-0. 3克,谷氨酸的用量可以为0. 2-0. 4克。所述淀粉质原料糖化清液既可以采用干法制糖工艺制备，也可以采用湿法制糖工艺制备。从工艺简单、设备投资少，生产成本较低的方面考虑，优选通过干法制糖工艺制备。干法制糖工艺是指淀粉质原料不经浸泡直接进行破碎和酶解。干法制糖工艺可以包括将淀粉质原料粉碎，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解；对第一次水解产物进行固液分离，并在得到的液相组分中加入糖化酶进行第二次水解，得到淀粉质原料糖化清液。其中，所述调浆的方法为本领域技术人员所熟知，优选地，调浆的方法可以包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均匀，水的加入量使得到的浆液的波美度可以为9-17B6。；所述淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备赖氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以为选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种。本发明中，所述淀粉质原料糖化清液中的葡萄糖含量为96-98重量％。上述种子培养基或发酵培养基中，所述淀粉质原料糖化清液可以由葡萄糖代替，相对于每升种子培养基，葡萄糖的添加量为28-39. 5克；相对于每升发酵培养基，葡萄糖的添加量为38-60克。本发明还提供一种上述的培养基在赖氨酸摇瓶发酵中的应用。本发明的赖氨酸摇瓶发酵方法包括将赖氨酸发酵菌种接种到培养基中进行摇瓶发酵，其特征在于，所述培养基为上述的培养基。本发明的发明人发现，随着发酵过程中硫酸铵等营养物质的消耗，发酵液的pH值逐渐下降，当PH值降至5. 4时，菌种代谢活动基本停止且不再产酸，但只要在pH降至5. 4后的3h内将发酵液的pH值调节到6. 8-7. 4，菌种又可以基本恢复产酸能力。因此，选用变色PH范围为5. 5-8的指示剂即可实现本发明的目的，优选情况下，选用变色pH范围为6. 5-8的指示剂。
本发明中，所述赖氨酸发酵菌种可以为本领域常规使用的赖氨酸发酵菌种，例如可以为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichia Coli)和黄色短杆菌(Brevibacterium fIavum)中的至少一种。本发明中，对所述赖氨酸摇瓶发酵的条件没有特殊限定，优选情况下，所述发酵的条件包括温度为30-38°C，pH值为6. 8-7. 4，时间为28_36h，摇床的转速为180_210rpm。本发明中，在摇瓶发酵过程中，可以通过添加氨水和/或液氨的方式调节pH值为6. 8-7. 4。本发明的发明人发现，使用上述发酵培养基进行赖氨酸摇瓶发酵时，每2小时观察发酵液的颜色变化并补加氨水和/或液氨时(本文中的每2小时表示如果8:00am观察发酵液的颜色变化并补加了氨水和/或液氨，那么等到10:00am时再观察发酵液的颜色变化并补加氨水和/或液氨，依此类推)，可以获得较佳的发酵结果并在最大程度上减轻操作人员的劳动强度。本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸发酵菌种在被接种至培养基中之前，采用常规方法将赖氨酸发酵菌种依次经过菌种活化和种子培养。种子培养的培养程度可以通过取样显微镜镜检、OD (optical density)值测定对产赖氨酸微生物的生长进行观察，当通过上述方法观察菌体形态正常、测定OD值达到0. 08以上时停止培养，将此时的种子液称为成熟种子液。然后再将成熟种子液接入培养基中。因此，本发明中，赖氨酸发酵菌种的接种量为12-18体积％，指的是接入发酵培养基中的成熟种子液的体积占接入成熟种子液后发酵培养基体积的12-18%。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，成熟种子液的培养方法包括配制种子培养基(具体组成为相对于每升培养基，葡萄糖的用量为35克，玉米浆(干重为35重量％)的用量为80克，磷酸氢二钾的用量为I. 0克，硫酸镁的用量为0. 5克，硫酸铵的用量为10克，苏氨酸的用量为0. 2克，蛋氨酸的用量为0. 2克)，121°C、102. 9kPa灭菌30分钟，将活化后的黄色短杆菌菌种(菌株原种FB42购自江南大学)接入冷却后的种子培养基中进行培养，培养过程中120分钟后，根据菌体生长情况每隔60分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0. 8时停止培养，得到成熟种子液。以下实施例中，发酵培养基的配方为相对于每升发酵培养基，葡萄糖的用量为50克，糖蜜(产地新疆)的用量为40克，玉米浆(干重为35重量％)的用量为30克，硫酸铵的用量为30克,磷酸氢二钾的用量为I. 0克,硫酸镁的用量为0. 5克,苏氨酸的用量为0. 2克，蛋氨酸的用量为0. 2克，谷氨酸的用量为0. 3克，适量的指示剂，调节pH值为6. 8。以下实施例中，按照GB10794-89标准检测发酵液中的赖氨酸含量(以赖氨酸盐酸盐计);按照GB/T5009. 7-2008的方法测定发酵液中还原性糖的浓度；pH值的检测使用梅特勒DeLTA320pH计；转化率(％)=产酸量/耗糖量X 100%，其中，产酸量等于发酵终点发酵液中的赖氨酸含量X发酵终点体积；耗糖量等于发酵培养基中还原性糖质量减去发酵终点发酵液中还原性糖质量；赖氨酸摇瓶发酵的稳定性通过计算发酵结束后三个500ml三角烧瓶中发酵液中赖氨酸含量的标准差来判断，标准差值越小，表明摇瓶发酵的稳定性越高，标
准差的计算公式为
权利要求
1.一种培养基，该培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有指示剂，所述指示剂的变色pH范围为5. 5-8O
2.根据权利要求I所述的培养基，其中，所述指示剂的变色pH范围为6.5-8。
3.根据权利要求I所述的培养基，其中，相对于每升培养基，所述指示剂的添加量为O. 002-0. 012 克。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的培养基，其中，所述指示剂为中性红、溴百里酚蓝、酚红、苯酚红和石蕊中的一种。
5.权利要求1-4中任意一项所述的培养基在赖氨酸摇瓶发酵中的应用。
6.一种赖氨酸摇瓶发酵方法，该方法包括将赖氨酸发酵菌种接种到培养基中进行摇瓶发酵，其特征在于，所述培养基为权利要求1-4中任意一项所述的培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述赖氨酸发酵菌种为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichia Coli)和黄色短杆菌(Brevibacterium fIavum)中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述摇瓶发酵的条件包括温度为30-38°C，pH值为6. 8-7. 4，时间为28-36h，摇床的转速为180_210rpm。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，在所述摇瓶发酵过程中，通过添加氨水和/或液氨的方式调节PH值为6. 8-7. 4。
全文摘要
本发明公开了一种培养基及其在赖氨酸摇瓶发酵中的应用与利用该培养基的赖氨酸摇瓶发酵方法，该培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有指示剂，所述指示剂的变色pH范围为5.5-8。通过上述技术方案，操作人员不需要进行取样检测pH值即可以直接根据培养基的颜色变化确定补加氨水或液氨的时间和加量，简化了发酵操作过程，缩短了调节pH值耗费的时间，降低了操作人员的劳动强度，进而降低了染菌几率。另外，添加的指示剂不会对发酵产生负面影响。因此，使用本发明的培养基进行赖氨酸摇瓶发酵时，发酵的稳定性明显增强。
文档编号C12R1/19GK102766662SQ20121026847
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者冯志菲, 卢宗梅, 吴晓艳, 张军华, 熊结青 申请人:中粮生物化学(安徽)股份有限公司