流式液相芯片急性高原病脯氨酰羟化酶基因rs480902位点检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人类基因诊断试剂盒，采用流式荧光杂交法定性检测急性高原病易感 基因中的SNP位点。适用于临床急性高原病易感基因的预测诊断，还可用于高原适应人群 和AMS患者基因组检测。
【背景技术】
[0002] 青藏高原地域辽阔、物产丰富，蕴含着巨大的经济发展潜力；青藏高原地处祖国西 南边睡，是重要的天然屏障，军事地理位置重要。但高原自然生存环境恶劣，在海拔3000 米高原，大气压降至537mmHg，仅为海平面的70%，大气氧分压为103mmHg，肺泡气氧分压为 62mmHg，高原缺氧导致机体劳动能力明显降低，在海拔4500米地区，人的体力只有平原的 60%。高原特殊的环境因素可导致高原病的发生，急性高原病（Acutemountainsiekness AMS)最为常见，危害也最大。流行病学调查显示，AMS多发生于海拔2500米以上的高原，而 我国海拔3000米以上的高原就占国土面积的1/6,常住人口约6000多万。目前AMS已经成 为我国高原地区的重大公共卫生问题，严重阻碍着当地经济、社会及各项事业的发展。由于 AMS发展迅速，后果严重，目前又缺乏非常有效的治疗措施，因此，寻找有效的预防措施显得 尤为迫切。AMS是一种多基因疾病，是高原低氧的环境因素和许多微效致病基因共同作用的 结果。大量研究表明，诱导AMS形成的易感基因产物在AMS患者和高原习服人群之间的表 达存在显著性差异。如果在进入高原之前，通过遗传标记的检测，将携带这种易感基因型的 个体筛检出来，避免其暴露于高原低氧环境，就能有效预防AMS的发生。但现有的实验室检 测方法均不能进行易感基因型检测。总之，研发急性高原病易感基因的预测诊断试剂盒仍 然是人们面对的挑战之一。
[0003] 流式液相芯片技术又称流式荧光技术或悬浮阵列流式荧光技术，其原理是将荧光 标记后的单细胞(或颗粒）悬液随鞘液进入流动室，压力迫使鞘液包裹的液滴包含单一细胞 或颗粒垂直通过检测区。荧光标记的细胞或颗粒在激光激发下发出荧光，根据其本身标记 的荧光和激发后发出的荧光综合分析进行检测。其在小样本、高通量、操作简便、快速准确、 敏感度、特异度高等方面优于传统的分析方法，而且其所有反应均在液相中进行，保持天然 构象，有利于探针和待测物充分反应，目前已广泛用于各类核酸及蛋白检测，如基因分型、 抗原/抗体检测、感染性疾病诊断等，其中HPV检测及分型试剂盒、呼吸道病毒检测试剂盒、 细胞因子检测试剂盒、肿瘤标志物检测试剂盒等已经在美国和中国经FDA及SFDA批准用于 临床检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的主要是提供一种高特异度、灵敏度，且具有同时检测多个样本、多个 指标能力的试剂盒。
[0005] 本发明通过下述技术方案实现： 流式液相芯片急性高原病脯氨酰羟化酶基因rs480902位点检测试剂盒，该试剂盒包 含特异性荧光微球交联探针微球杂交液、特异性PCR引物混合液、预混液、藻红蛋白荧光标 记链霉亲和素（SA-PE); 其中，特异性荧光微球交联探针及特异性PCR引物和探针序列如下： E-F5-2 :5'-CAAGTGATCTCCCAGTGACTCTT-3' E-F6-2 :5'-CAAGTGATCTCCCAGTGACTCTC-3' ； E-R3 :5,-GCAAAGTCAGAAAGCGGTG-3，； E-P0707 :5'-GGACCTTAGACCAGCACTTCT-3' 。
[0006] 进一步地，所述预混液由 4XBuffer、dNTPs、TaqPolymerase组成。
[0007] 具体地，预混液的用量为：10μ1，特异性PCR引物混合液的用量为：2μ1。
[0008] 另外，所述试剂盒还包含ddH20。具体地，ddH20的用量为：6μ1。在进行检测时， 待检DNA的用量为：2μ1。
[0009] 此外，所述特异性荧光微球交联探针微球杂交液是由探针Ε-Ρ0707与22号荧光微 球耦联、ΤΕ缓冲液及四甲基氯化氨杂交缓冲液制备。
[0010] 上述试剂盒在实际使用过程中的PCR反应条件为：首先热启动95°ClOmin，然后进 入35个循环；94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s;循环结束后72°C延伸lOmin。
[0011] 取PCR产物3μ1与22μ1微球杂交液混合，95 °C变性5min，48 °C杂交30min 后，加入SA-PE75μ1，48 °C温育15min。使用Luminex200流式荧光分析仪检测杂交产 物。
[0012] 本发明具有以下优点及有益效果： 本发明的试剂盒具有高特异度、灵敏度，而且具有同时检测多个样本、多个指标的能 力，可以用于临床急性高原病（AMS)重点易感基因的检测诊断，还可应用于应对批量需要急 进高原的人群，短时间内进行检测并分型。
【附图说明】
[0013] 图1为1号标本EGLN1位点测序结果。
[0014] 图2为2号标本EGLN1位点测序结果。
[0015] 图3为3号标本EGLN1位点测序结果。
[0016] 图4为4号标本EGLN1位点测序结果。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。 实施例
[0018] 急性高原病（AMS)易感基因SNP位点的选择： 使用NCBI核酸数据库公开信息及文献调研，筛选高原急性不适易感靶基因及位点，通 过生物信息学比对研究，筛选急性高原病（AMS)易感基因，对选取的AMS易感基因SNP位点 的序列号查询和基因组序列下载。SNP位点的选择原则：该位点尽量位于基因编码区、调控 区等蛋白活性关系密切的区域，各SNP位点基因频率分布资料均来自中国汉族人群。根据 SNP位点选择原则，选定1个易感基因的1个SNP位点。所选SNP位点为：脯氨酰羟化酶 (EGLN1)基因：rs480902。
[0019] 通过对SNP位点的选择，本申请研究出了以下试剂盒： 该试剂盒包含特异性荧光微球交联探针微球杂交液、特异性PCR引物混合液、预混液、 藻红蛋白荧光标记链霉亲和素。
[0020] 所述预混液由4X Buffer、dNTPs、Taq Polymerase组成。该预混液可从市面上直 接购买。
[0021] 所述特异性荧光微球交联探针微球杂交液是由探针（E-P0707号）与22号荧光微 球耦联、TE缓冲液及170μ1四甲基氯化氨（TMAC)杂交缓冲液制备。其具体的制备方法 和采用的其他原料均是现有技术，本发明仅是采用了不同的探针和荧光微球，然后制备方 法是现有的。
[0022] 上述特异性荧光微球交联探针及特异性PCR引物和探针序列如下： E-F5-2 :5'-CAAGTGATCTCCCAGTGACTCTT-3' E-F6-2:5'-CAAGTGATCTCCCAGTGACTCTC-3'； E-R3 :5,-GCAAAGTCAGAAAGCGGTG-3，； Ε-Ρ0707:5'-GGACCTTAGACCAGCACTTCT-3'。
[0023] 具体地，试剂盒中的预混液用量为：10μ1，特异性PCR引物混合液用量为：2μ1。
[0024] 另外，所述试剂盒还包含ddH20。具体地，ddH20的用量为：6μ1。在进行检测时， 待检DNA的用量为：2μ1。也就是说本申请试剂盒的PCR反应体系的总体积为20μ1。
[0025] 然而，PCR反应条件为：首先热启动95°ClOmin，然后进入35个循环；94°C变性 30s，64°C退火30s，72°C延伸30s;循环结束后72°C延伸lOmin。杂交反应条件为取PCR产 物3μL与22μL微球杂交液混合，95 °C变性5min，48 °C杂交30min后，加入SA-PE75 μ1，48 °C温育 15min。
[0026] 本发明的试剂盒使用时，引物对为两对：①E-F5-2\E-R3,②E-F6\E-R3。采用 Luminex200流式焚光检测仪进行检测。
[0027] 本发明的临床验证： 采集2015年1月西藏某医院收治的3例临床诊断为急性高原病的患者全血，提取DNA采用AMS易感基因流式液相芯片检测并分型。通过扩增、杂交并用LumineX200流式荧光检 测仪检测，检测结果如表1。
[0028] 表1急性高原病的患者流失液相芯片检测结果
结果表明，如果只有引物对①或引物对②的产物杂交结果是阳性(MFI> 500)，则判定 为纯合突变，SNP类型为引物对①或引物对②带有的碱基类型。如果引物对①和引物对② 的产物杂交结果都呈阳性，则判定为杂合突变。
[0029] 检测后将基因组DNA进行测序验证结果(华大基因），测序结果见图1~4。病例标 本编号为：1、2、3、4,测序结果与本发明检测结果完全吻合。
[0030] 4例急性高原病的患者标本中，EGLN1 (rs480902)突变4例；其中编号1的病例 为杂合突变，编号2为纯合突变C，编号3的病例为杂合突变，编号4的病例为纯合C突变。 说明该方法与临床诊断一致性非常好。
【主权项】
1. 流式液相芯片急性高原病脯氨酰羟化酶基因rs480902位点检测试剂盒，其特征在 于，该试剂盒包含特异性荧光微球交联探针微球杂交液、特异性PCR引物混合液、预混液、 澡红蛋白9?光标记链霉未和素； 其中，特异性荧光微球交联探针及特异性PCR引物和探针序列如下： E-F5-2 :5'-CAAGTGATCTCCCAGTGACTCTT-3' E-F6-2 :5'-CAAGTGATCTCCCAGTGACTCTC-3'； E-R3 :5,-GCAAAGTCAGAAAGCGGTG-3，； E-P0707:5'-GGACCTTAGACCAGCACTTCT-3' 。2. 根据权利要求1所述的流式液相芯片急性高原病脯氨酰羟化酶基因rs480902位点 检测试剂盒，其特征在于，预混液的用量为：1〇μ1，特异性PCR引物混合液的用量为：2μ1。3. 根据权利要求1或2所述的流式液相芯片急性高原病脯氨酰羟化酶基因rs480902 位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含ddH20。4. 根据权利要求3所述的流式液相芯片急性高原病脯氨酰羟化酶基因rs480902位点 检测试剂盒，其特征在于，ddH20的用量为：6μ1。5.根据权利要求1所述的流式液相芯片急性高原病脯氨酰羟化酶基因rs480902位点 检测试剂盒，其特征在于，所述特异性荧光微球交联探针微球杂交液是由探针E-P0707与 22号荧光微球耦联、TE缓冲液及四甲基氯化氨杂交缓冲液制备。
【专利摘要】本发明公开了一种流式液相芯片急性高原病脯氨酰羟化酶基因rs480902位点检测试剂盒，该试剂盒包含特异性荧光微球交联探针微球杂交液、特异性PCR引物混合液、预混液、藻红蛋白荧光标记链霉亲和素。本发明的试剂盒具有高特异度、灵敏度，而且具有同时检测多个样本、多个指标的能力，可以用于临床急性高原病（AMS）重点易感基因的检测诊断，还可应用于应对批量需要急进高原的人群，短时间内进行检测并分型。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105296631
【申请号】CN201510743104
【发明人】熊怡淞, 秦燕, 吴艾霖, 刘毓刚, 肖毅
【申请人】吴艾霖
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月4日