一种检测鸡住白细胞原虫的方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及鸡住白细胞原虫的检测。
【背景技术】
[0002] 住白细胞原虫属于原生动物门、复顶亚门、孢子虫纲、血孢子虫亚目、疟原虫科、住 白细胞虫属。鸡住白细胞虫病是由住白细胞虫属的多种住白细胞虫寄生于鸡的白细胞和红 细胞引起的一种急性血孢子原虫病。病鸡因红细胞被破坏及广泛性出血，鸡冠呈苍白色，故 又名白冠病。近年来该病在我国许多地区暴发流行，对养鸡业的危害日趋严重。
[0003] 对于该疾病的检测，一般是利用PCR方法检测鸡住白细胞原虫，这通常需要先提 取待检鸡样品的DNA，因为样品中的一些抑制剂会对PCR反应的聚合酶产生抑制作用。然而 对于大规模鸡养殖业而言，提取样品中的DNA耗费时间过长，成本太高，非常不适用。本领 域中急需要一种能够快速且低成本的检测鸡住白细胞原虫的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种检测鸡住白细胞原虫的方法以及相应的试剂盒，能够 免提取DNA，从而解决现有技术中存在的上述问题。
[0005] 本发明所采取的技术方案是：
[0006] -种检测鸡住白细胞原虫的方法，包括以待检鸡样品为模板，以PCR的方法检测 鸡住白细胞原虫是否存在，PCR的反应试剂包括上游引物、下游引物、TaqMan荧光探针、Taq 酶、Taq酶稀释液，其中，所述方法不包括从待检鸡样品中提取DNA的过程。
[0007] 优选地，所述Taq酶稀释液包含高聚复合物M，所述高聚复合物Μ是通过将双（环 戊二烯）镁（分子式：C1QH1QMg)和曲拉通X-114(TritonX-114)，按质量比140~160 : 1， 在200~210°C、300~350kpa、l~3小时条件下进行加成反应而形成的，为白色粉末，完 全溶于水。
[0008] 进一步优选地，所述双（环戊二烯）镁和曲拉通X-114的质量比是154 : 1，所述 反应条件为207°C、314kpa、2小时。
[0009] 优选地，所述Taq酶稀释液中，高聚复合物Μ的含量为0.1 %~0.6%W/V。
[0010] 进一步优选地，所述Taq酶稀释液的成分为：20mMTris-HCl，0.ImMEDTA，100mM KCl，lmMDTT，0.5% (V/V)NP-40(乙基苯基聚乙二醇），0·5% (V/V)吐温-20,50% (V/V) 甘油，0. 1% (W/V)高聚复合物Μ。
[0011] 优选地，所述Taq酶稀释液将Taq酶稀释至1U/μL，再将稀释的Taq酶按比例加入 PCR反应体系中。
[0012] 优选地，所述方法通过检测鸡住白细胞原虫的cytb基因检测鸡住白细胞原虫是 否存在。
[0013] 优选地，所述上游引物为：LB-F:5 ' -CCACCACATACCCATGAGATTAGTC-3'（SEQID NO. 1)，所述下游引物为：LB-R:5'-AACTGCCTTCTTAGGTTATGTATTACCAT-3'（SEQIDNO. 2)，所 述TaqMan荧光探针为：LB-P :5' -Fam-TTACAGTTGCACCCCAGAAACTCATTTGG-3' BHQ1 (SEQ ID NO. 3)〇
[0014] 优选地，所述待检鸡样品为鸡任何部位，优选为全血。
[0015] 优选地，所述方法包括步骤：以待检鸡样品的全血为模板，加入针对cytb基因的 上游引物、下游引物和荧光探针以及用Taq酶稀释液处理的Taq酶、PCR缓冲液、dNTP混合 物等PCR反应试剂，通过变性、退火、延伸等PCR程序扩增cytb基因上的目标片段，从而判 断鸡住白细胞原虫是否存在。
[0016] 一种检测鸡住白细胞原虫的试剂盒，包括上游引物、下游引物、TaqMan荧光探针、 Taq酶、Taq酶稀释液、PCR缓冲液、dNTP混合物。
[0017] 优选地，所述上游引物为：LB-F :5'-CCACCACATACCCATGAGATTAGTC-3'（SEQ ID NO.1)，所述下游引物为：LB-R :5'-AACTGCCTTCTTAGGTTATGTATTACCAT-3'（SEQ IDNO.2)，所 述TaqMan荧光探针为：LB-P :5' -Fam-TTACAGTTGCACCCCAGAAACTCATTTGG-3' BHQ1 (SEQ ID NO.3)〇
[0018] 优选地，所述Taq酶稀释液包含高聚复合物M，所述高聚复合物M是通过将双（环 戊二烯）镁（分子式：C1QH1QMg)和曲拉通X-114,按质量比140~160 : 1，在200~210°C、 300~350kpa、l~3小时条件下进行加成反应而形成。
[0019] 进一步优选地，所述双（环戊二烯）镁和曲拉通X-114的质量比是154 : 1，所述 反应条件为207°C、314kpa、2小时。
[0020] 优选地，所述Taq酶稀释液中，高聚复合物Μ的含量为0· 1 %~0· 6%W/V。
[0021] 进一步优选地，所述Taq酶稀释液的成分为：20mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，100mM KCl，lmM DTT，0.5% (V/V)NP-40(乙基苯基聚乙二醇），0·5% (V/V)吐温-20,50% (V/V) 甘油，0. 1% (W/V)高聚复合物Μ。
[0022] 本领域技术人员已知，TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探 针的5'末端，而淬灭剂则连接在3'末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异 性的荧光探针，探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶 的Y-3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测 系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的 累积与PCR产物的形成完全同步。
[0023] 本发明中的高聚复合物Μ可以保护结合的Taq酶耐受更高的温度；借由更高的变 性温度，一方面，可以使复杂的模板更容易地变性，使Taq酶可以更容易结合这些复杂的模 板；另一方面，此高聚复合物Μ会阻挡一些抑制剂（如金属离子），从而使得反应体系可以 扩增全血等待检测鸡样品，不需要提取DNA。
[0024] 本发明引入了特异性扩增引物和荧光探针，用以保证反应的特异性。并加入了高 聚复合物Μ，使得PCR体系可以进行血液直扩，无需提取DNA，降低了样品处理的复杂度，能 够对鸡住白细胞原虫进行快速检测，应用极为方便，适合在家禽养殖企业、检验检疫机构等 进行推广应用，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0025]图1为使用本发明的试剂盒对鸡住白细胞原虫检测的敏感性实验，从左到右依次 为1X106、1X105、1X104、1X103、1X102拷贝/μ1的标准品的扩增结果。
[0026]图2为使用本发明的试剂盒对鸡减蛋综合征病毒（EDSV)、禽白血病病毒（ALV)、鸡 传染性贫血病病毒（CIAV)样本检测的特异性实验结果。
[0027]图3为使用未添加高聚复合物Μ的PCR体系检测鸡住白细胞原虫、鸡减蛋综合征 病毒（EDSV)、禽白血病病毒（ALV)、鸡传染性贫血病病毒（CIAV)样本的对照实验结果。
[0028] 图4为双（环戊二烯）镁单体的分子式。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例，进一步阐述本
【发明内容】
。
[0030] 实施例一：特异性引物及探针的设计
[0031] 根据从Genbank上检索到的住白细胞虫属的核酸序列（gi| 296011935、 gi|296011933、gi|568261041、gi|568261039、gi|568261037、gi|296011937、 gi|296011925、gi|296011923、gi|296011921、gi|296011929、gi|296011931、 giI296011927)，设计用于检测鸡住白细胞原虫cytb基因的引物和探针，并逐一进行实验 验证，最终确定如下引物和探针：
[0032]上游引物：LB-F:5' -CCACCACATACCCATGAGATTAGTC-3'（SEQIDNO. 1)，
[0033]下游引物：LB-R:5' -AACTGCCTTCTTAGGTTATGTATTACCAT-3'（SEQIDNO. 2)，
[0034]荧光探针：LB-P:5' -Fam-TTACAGTTGCACCCCAGAAACTCATTTGG-3'BHQ1(SEQID NO. 3),
[0035] 所述引物扩增片段长度为114bp，序列如下：
[0036]CCACCACATACCCATGAGATTAGTCCAGGAATAAAATATAGTAAATTAGTAATTACAGTTGCACCCCAG AAACTCATTTGGCCCCATGGTAATACATAACCTAAGAAGGCAGTT(SEQIDNO. 4)〇
[0037] 实施例二：标准品的制备
[0038] 采集来自河北秦皇岛市的病鸡肺组织，用Roche公司的HighPurePCRTemplate PreparationKit提取DNA作为模板，进行PCR扩增，步骤如下：
[0039] 1)PCR体系：