用于检测女性原发不孕的VIII型β-微管蛋白基因及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测女性原发不孕的VIII型 β-微管蛋白基因及试剂盒。VIII型β-微管蛋白基因突变是导致女性原发不孕的原因。通 过检测此基因是否发生突变，可用来对不孕症进行诊断及判断，并对病人后续进行试管婴 儿，选择IVF/ICSI的方法或结局进行指导。
【背景技术】
[0002] 正常怀孕及生殖是维持及延续人类种群的重要环节。临床中，AZF基因的微缺 失检测已经被广泛用于男性不育患者的诊断中（PryorJLetal,Microdeletionsin theYchromosomeofinfertilemen.NEnglJMed. 1997Feb20; 336 (8) ; 534-9)〇 在研究方面，目前已经有ZP-1，Stag3,FSHR等基因被发现与女性不孕症密切相关 (HuangHLetal,MutantZP1infamilialinfertility.NEnglJMed. 2014 370(13):1220-6;deRouxNetal,Afamilywithhypogonadotropichypogonadismand mutationsinthegonadotropin-releasinghormonereceptor.NEnglJMed. 1997 337(22):1597-602;CaburetSetal,Mutantcohesioninprematureovarianfailure. NEnglJMed. 2014 370(10) :943-9)。但是，均未在临床中应用。
[0003] 导致女性不孕症的原因很多，有一些临床报道涉及以卵子不成熟为 特征的女性不孕症的描述（Rudaketal,fertilityandsterility, 1990 54:292-296;HumanReproduction, 1995 10:2343-2349;fertilityandsterility1999 71:567-570;HumanReproduction2001 16 (10):2136-2138;HumanReproduction2002 17(6) :1604-1609;HumanR印roduction2002 17(10) :2556-2559)。这些病人通过反复进 行授精-胚胎移植术(试管婴儿)，均因未能获取到成熟卵细胞，而无法完成成功的体外授精 操作。如果能发现相关致病基因，则对疾病临床诊断及分型都具有重要意义。但是，目前还 未有以卵子不成熟导致的女性不孕症的基因被发现。
[0004]VIII型β-微管蛋白基因（Tubulin，beta8classVIII，TUBB8)属于编码微管蛋 白家族9个成员之一。微管蛋白家族的其他基因已经被发现在神经精神类疾病中发挥重 要作用。但是，VIII型β-微管蛋白基因的功能及与女性不孕的关系至今未知。
[0005] 经对现有技术文献的检索发现，至今未见关于TUBB8基因的任何报道。也未发现 其与女性不孕症相关的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种操作方便、效果明确的用于检测女性原发不孕的VIII 型β-微管蛋白基因及检测该基因突变的试剂盒。
[0007] 本发明提供的用于检测女性原发不孕的VIII型β-微管蛋白基因（TUBB8)的核酸 序列如SEQIDNO. 1所示。
[0008] 本发明涉及筛查因卵子不成熟而致原发性不孕的方法，就是通过检测TUBBS基因 是否发生突变来判断病人是否为卵子不成熟而导致的原发性不孕。从患者的外周血中提取 DNA后，用PCR(多聚酶链式反应）法结合DNA测序，来检测TUBB8基因是否发生了突变。
[0009] 本发明涉及检测TUBB8基因是否发生突变的引物。
[0010]检测TUBB8基因是否发生突变的方法如下：TUBB8有四个外显子。对其中1-3号 外显子，利用引物对： 5' -AGTTCCCAGAGGATGACCTTAGCA-3'（SEQIDN0.2)， 5' -GCTATTTAAACGTTGGCGGAGG-3'（SEQIDNO. 3)， 进行PCR扩增(扩增条件：92°C2分钟，92°C30秒，57°C1分钟，72°C3秒(此三步重 复35个循环)，72°C10分钟)，然后利用相同的引物进行测序，与UCSC中TUBB8的标准序 列（SEQIDNO. 1)进行比对，从而发现突变； 对其中第4号外显子，利用引物对： 5' -ACCAGGAGACCATCACACAG-3'（SEQIDN0.4)， 5' -CGCTCAATCTGCCTCTCCTA-3'（SEQIDNO. 5)， 进行PCR扩增(扩增条件：92°C2分钟，92°C30秒，61°C1分钟，72°C3秒(此三步重 复35个循环)，72°C10分钟；然后利用引物对： 5' -AACGCAGCAGGAGATGTGAA-3'（SEQIDN0.6)， 5' -CCCTGCAAGAACCTGAGCTG-3'(SEQIDNO. 7), 进行测序，再与UCSC中TUBB8的标准序列（SEQIDNO. 1)进行比对，从而发现突变。通 过PCR及一代测序，及与标准序列的比对，来检测TUBB8基因是否发生突变。
[0011] 本发明还提供一种检测卵子不成熟致原发性不孕的筛查试剂盒。此试剂盒可以 指导医生对疾病病因的判断、对疾病进行正确分类，从而告知患者采用IVF法还是ICSI法 进行试管婴儿操作，以及是否适合继续施行体外授精-胚胎移植术（IVF)或单精子注射术 (ICSI)(试管婴儿)。
[0012] 本发明提供的试剂盒，包括上述扩增TUBB8的1-4号外显子的扩增引物及测序引 物（SEQIDNO. 2-SEQIDN0. 7)及反应混合液；反应混合液包括DNA聚合酶、dNTP及缓冲 液； 具体使用方法为：将引物用水稀释为10uM浓度的工作液。反应体系为10ul，其中，lul样本DNA，0. 5ul正向引物，0. 5ul反向引物，5ul反应混合液及3ul的水组成。混合后，按上 述条件进行PCR反应，而后进行一代测序。
[0013] 本发明还提供用于研究药物治疗卵子不成熟致原发性不孕的基因修复靶位点（即 实际检测出的病人的突变位点，比如在表1中列出了 7个突变位点，实际检测过程中，通过 与标准序列比对，可能会存在新的突变位点)，并通过对靶位点的修复，从而使得TUBB8可以 行使正常功能，进而可以治疗此种疾病。
[0014] 本发明还可通过检测TUBB8基因的突变，指导临床具有此基因突变的病人，应采 用哪种手术方法（IVF或ICSI)进行试管婴儿术。常规临床中，夫妇希望进行试管婴儿时， 如果男方不是严重少弱精，一般首先采用IVF的方法进行试管婴儿术。但是，如果病人通过 检测发现具有TUBB8的突变，那么对此病人应当直接采用ICSI进行试管婴儿术。因为，具 有此突变的病人的卵子是不成熟的，所以应采用ICSI方法，对获得的卵子进行体外成熟培 养尝试，而不应采用IVF。
【附图说明】
[0015] 图1为病人突变为在TUBB8结构上的分布展示。
【具体实施方式】
[0016] 以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。
[0017] 实施例1:样本的收集和外周血DNA的抽提 卵子不成熟致原发性不孕患者来自于中国上海复旦大学附属红房子医院上海集爱遗 传与不育诊疗中心、中国上海交通大学附属第九人民医院生殖中心。诊断标准由RudakE 等人（RudakE. ,DorJ. ,KimchiM. ,GoldmanB. ,LevranDandMashiachS,Anomalies ofhumanoocytesfrominfertilewomenundergoingtreatmentbyinvitro fertilization.FertilSteril. 1990Aug; 54(2) :292-6)提出D 男方精液检查正常，女方 患者雌性生殖器官、卵巢功能、性激素均正常，2次以上促排周期每次取到5个以上卵子，均 未有可见第一极体形态。在知情同意的前提下参加本课题的研究，采集血液，并签署知情同 意书。所有入组患者均通过病史排除其他生殖内分泌疾病。本实验的对照人群为1000个 生育功能正常的女性，取样本血液300U1，按试剂盒说明书提取DNA，用紫外分光光度仪检 测DNA浓度和纯度。
[0018] 实施例2:检测TUBB8基因的突变 本发明采用PCR结合测序进行TUBB8基因突变的寻找。其原理是先对TUBB8基因的 四个外显子进行引物设计(可具体给出引物序列)及扩增，进行TUBB8基因突变的寻找。（即 将DNA样本与反应工作液（DNA聚合酶、dNTP，水及缓冲液）混合后混匀，依照PCR程序进行 扩增。所得产物，经过纯化及进一步测序反应，在ABI3730测序上测序。结果分析通过HLA Fusion软件（Onelambda,CA,USA,HLAFusion3.0)进行。扩增 1-3 号外显子的PCR 引物为：
[0019] 实施例3:TUBB8基因突变与因卵子不成熟而致原发性不孕 结果：我们共搜集到TUBB8基因突变所致因卵子不成熟而致原发不孕患者7例。相应 突变位点信息见下表(表1)。突变位点在结构上的分布见图1所示。
[0020] 表1病人TUBB8基因突变信息
综上所述，本发明的具有如下重要实际意义： (1) 可以利用本发明提出的TUBB8基因作为预测因卵子不成熟致女性不孕的标记基 因； (2) 利用本发明提供的TUBB8基因可用于评价或制备因卵子不成熟致女性不孕的筛查 试剂盒； (3) 利用本发明提供的TUBB8基因可用于指导临床具有此基因突变的病人，应采用哪 种手术方法（IVF或ICSI)进行试管婴儿术。
[0021]所述SEQIDN0.1: (a) 序列特征： 长度：1335碱基对 类型：核酸 链型：双链 拓扑结构：线形 (b) 分子类型：cDNA (c) 假设：否 ⑷反义：否 (e) 最初来源：人 (f) SEQIDNO. 1核酸序列如下：
【主权项】
1. 用于检测女性原发不孕的VIII型β-微管蛋白基因（TUBB8)，其核酸序列如SEQID NO. 1所示。2. 用于检测TUBB8基因是否发生突变的引物，其特征在于，对于TUBB8基因的四个外显 子，用于检测第1-3号外显子的PCR扩增引物对为： 5' -AGTTCCCAGAGGATGACCTTAGCA-3' ， 5' -GCTATTTAAACGTTGGCGGAGG-3'， 测序引物对同上； 用于检测第4号外显子的PCR扩增引物对为： 5' -ACCAGGAGACCATCACACAG-3' ， 5' -CGCTCAATCTGCCTCTCCTA-3'， 测序引物对为： 5' -AACGCAGCAGGAGATGTGAA-3， 5' -CCCTGCAAGAACCTGAGCTG-3'。3. 用于检测TUBB8基因是否发生突变的方法，其特征在于具体步骤如下： TUBB8有四个外显子，对其中第1-3号外显子，利用引物对： 5' -AGTTCCCAGAGGATGACCTTAGCA-3' ， 5' -GCTATTTAAACGTTGGCGGAGG-3'， 进行PCR扩增，然后利用相同的引物进行测序，与UCSC中TUBB8的标准序列SEQID NO. 1进行比对，从而发现突变； 对其中第4号外显子，利用引物对： 5' -ACCAGGAGACCATCACACAG-3' ， 5' -CGCTCAATCTGCCTCTCCTA-3' ， 进行PCR扩增；然后利用引物对： 5' -AACGCAGCAGGAGATGTGAA-3，， 5' -CCCTGCAAGAACCTGAGCTG-3' ， 进行测序，再与UCSC中TUBB8的标准序列SEQIDNO. 1进行比对，从而发现突变。4. 一种用于检测卵子不成熟致原发性不孕的筛查试剂盒，其特征在于试剂盒包括上 述扩增TUBB8基因的1-4号外显子的扩增引物及测序引物：SEQIDNO. 2-SEQIDNO. 7及 反应混合液；反应混合液包括DNA聚合酶、dNTP及缓冲液。
【专利摘要】本发明属于基因检测技术领域，具体为用于检测女性原发不孕的VIII型？-微管蛋白基因及试剂盒。本发明涉及的人类微管蛋白基因-VIII型？-微管蛋白基因：TUBB8基因，它的突变时是导致因卵子不成熟致女性不孕的原因。通过检测TUBB8基因的突变可作为判断因卵子不成熟致女性不孕的标记基因。利用本发明提供的TUBB8基因可用于评价或制备因卵子不成熟致女性不孕的筛查试剂盒。利用本发明提供的TUBB8基因可用于指导临床相应患者进行试管婴儿术时的操作方法；利用本发明提供的TUBB8基因可用于评价或制备IVF/ICSI有效性的筛查试剂盒。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/12
【公开号】CN105296634
【申请号】CN201510755090
【发明人】王磊, 冯睿芝, 桑庆, 胥尧
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月9日