一种快速检测鸡白痢沙门氏菌的pcr-hrm引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是微生物检测，分子诊断。具体涉及一种快 速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR-HRM引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 鸡白痢沙门氏菌（SalmonellaPullorum)属于肠道杆菌科沙门氏菌属，D血清 型中的一员。主要感染鸡和火鸡，临床表表现以雏鸡拉白色糊状稀粪为特征，死亡率高。 Rettger于1899年首次报道了鸡白痢沙门氏菌病，次年将本病命名为"雏鸡致死性败血 症"1929年正式将本病命名为"鸡白痢"。在所有饲养鸡和火鸡的地区均有本病的发生和存 在，在哺乳动物中，兔具有高度易感性，有人曾在猪体内分离到该菌，儿童亦偶有感染本病 的报道。目前，受沙门氏菌污染的家禽及相关产品已经成为人类沙门氏菌感染和食物中毒 的主要来源之一。另外，随着养禽业的迅猛发展，鸡白痢沙门氏菌病已成为家禽最总要的细 菌病之一，并列为国家规定净化的细菌病，每年造成的经济损失非常可观。
[0003] 快速鉴别和诊断鸡白痢沙门氏菌是净化和防治的基础，传统的鉴定方法周期长、 灵敏度低、特异性差，如采集完样品需要预增液BPW增菌（8~18h)，然后选择性增菌液 (TTB、SC等）培养（18~24h)，再把增菌液接种到显色平板上培养（18~24h)，接着挑 选可疑菌落进行生化鉴定及血清学鉴定（12~48h)。利用血清学诊断与鸡伤寒沙门氏菌 (Salmonella Gallinarum)具有很高的交叉凝集反应性。另外，肠炎沙门菌（9,12:g，m:_) 的无动力变种（9,12因失去Η相（g，m)抗原表达能力而无法用诊断血清确认（g和m 因子），而纯粹依据抗原式（9,12:-:-)则会误判为鸡白痢沙门氏菌，所以在国家提倡净化 养殖场沙门氏菌的背景下，寻找一种高效、特异、快速的鸡白痢沙门氏菌检测方法具有重要 的公共卫生意义和经济效益。
[0004] 高分辨率恪解曲线（high-resolutionmelting，HRM)是一种基于单核苷酸恪解 温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单 个碱基的差异，SNP位点碱基不同会使双链DNA的Tm值发生变化从而双链DNA在升温过程 中先后解开，形成不同的融解曲线形状，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强 度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响 熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。SYBR?GreenI 对PCR有抑制作用，必需使用低浓度；即使是高浓度也不能饱和插入DNA双螺旋结构中的小 沟，非饱和态结合使染料在熔解过程中发生重排，染料分子重新结合到双链DNA的空置位 点，造成荧光信号没有变化，特异性下降。饱和染料在饱和浓度（荧光最大）下，也不会抑 制PCR;高浓度的染料饱和插入DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重 排，熔解曲线有更高的分辨率，饱和染料主要有LCGreen、LCGreenPlus、CYT09等。高分 辨率熔解曲线在病原菌检测方面成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限， 实现了真正的闭管操作。在病原菌检测方面有着巨大的应用前景。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种快速检测鸡白 痢沙门氏菌的PCR-HRM引物。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR-HRM方法。该方 法具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高且高通量、低成本的特点，能够广泛的应用于兽 医临床检测，为养殖厂鸡白病沙门氏菌的净化提供快速、尚效的方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供所述快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR-HRM引物的应 用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] -种快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下：
[0010] 上游引物rfbS-F:5^ -AAAGCAATATTCTTATGCCTA-3'或者其核苷酸的互补序列；
[0011] 下游引物rfbS-R:5' -CACAATTTATGAATACTGCATCHy或者其核苷酸互补序列。
[0012] -种快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR-HRM方法，包括以下步骤：
[0013] A:提取细菌DNA;
[0014] B:以DNA为模板，利用上述所述的上游引物rfbS-F、下游引物rfbS-R和饱和荧光 染料进行扩增反应，获得扩增产物；
[0015] C:对扩增产物进行HRM分析，确定是否为鸡白痢沙门氏菌。
[0016] 进一步的，步骤B所述的PCR扩增反应体系为：
[0017]
[0018] 所述的饱和焚光染料优选为Eva green染料。
[0019] 所述的引物rfbS-F和引物rfbS-R的浓度各优选为lOnmol/μL;
[0020] 进一步的，步骤Β所述的扩增反应程序为：
[0021]
[0022] 进一步的，步骤C所述的HRM分析的具体分析过程为：以鸡白痢沙门氏菌标准阳性 模板扩增后的熔解温度Tm值为参考，待测样品熔解温度Tm值置信值（GCP)大于95%为鸡 白痢沙门氏菌。
[0023] 所述的快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR-HRM引物可应用于鸡白痢沙门氏菌的检 测，养殖场鸡白痢沙门氏菌的净化，分子流行病学调查以及家禽养殖中鸡白痢沙门氏菌的 风险评估。
[0024] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0025] (1)本发明首次建立了一种快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR-HRM引物并应用，其 操作方便，检测时只需要在PCR反应中加入饱和荧光染料；简化了临床检验的流程并且大 大缩短了检测时间，与传统国标鉴定方法相比时间节省了 2/3 ;并且该方法具有高通量、低 成本的特点，一次最多可以检验384个样本。
[0026] (2)与传统PCR后电泳开放操作相比，本发明从PCR过程到HRM分析实现了真正的 闭管操作，整个过程PCR产物无需再转入其他装置，避免了交叉污染，并且可以完成定量分 析。
[0027] (3)本发明无需特异性的探针，无需测序，使用简便，并且检验过程中不消耗PCR 产物，可以进一步进行下游分析。
[0028] (4)本发明特异性强，能够很好的从肠炎沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌以及其他细 菌中区分鸡白痢沙门氏菌，解决了传统检测方法鉴别鸡白痢沙门氏菌准确率低的问题。本 发明灵敏度高，最低检测下限能达到34个拷贝数每微升（yL)。在鸡白痢沙门氏菌的快速 诊断中展示了广阔的应用前景。
【附图说明】
[0029] 图1是鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌标准样品HRM标准化熔 解曲线图。
[0030] 图2是鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌及其他细菌标准样品 HRM峰型化熔解曲线图。
[0031]图3是特异性检测及鸡白痢沙门氏菌临床样品检测峰型化熔解曲线图。
[0032]图4是鸡白痢沙门氏菌灵敏度检测峰型化熔解曲线图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0034] 实施例1引物
[0035] 根据NCBI已公布的沙门氏菌全基因组序列以及查阅相关资料发现鸡白痢沙门氏 菌（SalmonellaPullorum)在rfbS基因上237有规律性的变化，所有鸡白痢都为G，而鸡伤 寒、肠炎等血清型为A，别的一些血清型和别的种类的菌株不含有该基因或者变化较大，固 可根据此位点设计特异扩增引物。
[0036] 采用01igo7引物设计软件，根据GeneBank发布的沙门氏菌rfbS序列（鸡白 痢沙门氏菌的rfbS序列的GeneBank登录号：LK931482 ;鸡伤寒沙门氏菌的rfbS序列 的GeneBank登录号：AF442573 ;肠炎沙门氏菌rfbS序列的GeneBank登录号：CP007267) 以及鸡白痢沙门氏菌标准菌株测序获得的rfbS序列（该rfbS序列与GeneBank登录 号：LK931482中的相同），在rfbS基因237位点两侧设计引物对。上游引物rfbS-F: 5 ' -AAAGCAATATTCTTATGCCTA-3';下游引物rfbS-R:5 ' -CACAATTTATG