一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的elisa试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明通过免疫沉淀技术筛选鸡白痢沙门氏菌优势抗原GroEL，利用原核表达载体表达GroEL重组蛋白，并利用该抗原蛋白建立了检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒。本发明试剂盒在检测鸡白痢沙门氏菌抗体过程中能够减少鸡的应激，并提高检测特异性和敏感性。
【专利说明】—种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗原制备及ELISA试剂盒，具体地说，涉及一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002]鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的败血性传染性疾病，其排泄物是重要的传播媒介，同时也可通过鸡蛋垂直传播，是危害养鸡业最严重的疾病之一。
[0003]鸡白痢沙门氏菌多侵害20日龄以内幼雏，引起白色下痢，病死率极高，成年鸡则可带菌而无临床症状。该病既可垂直传播，又有严重的水平传播，所以造成的危害和经济损失巨大。目前西方国家已完全消灭了鸡白痢，但我国仍然爆发严重。常规的鸡白痢检测方法为平板凝集，通过针刺鸡采血，在平板上与鸡白痢、鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原混合,通过出现凝集现象来判断是否感染鸡白痢沙门氏菌。由于通过针刺采血对鸡应激大,容易造成鸡的生产性能下降，甚至肝脾破裂死亡，蛋鸡尤为明显，同时大型鸡场存栏量大，工作量繁重，而一般阴性血清在足够时间下也会产生凝集，易造成假阳性。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是建立一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA方法，在检测鸡白痢过程中减少鸡的应激，提高特异性和敏感性。
[0005]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，所述试剂盒内含有鸡白痢沙门氏菌抗原GroEL蛋白。
[0006]进一步地，所述试剂盒内设有:包被鸡白痢沙门氏菌抗原的抗体检测板,酶标抗体，阳性对照为鸡白痢阳性血清，阴性对照为鸡白痢阴性血清。
[0007]作为优选，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体。
[0008]进一步地，所述鸡白痢沙门氏菌抗原GroEL蛋白为纯化的鸡白痢沙门氏菌重组蛋白 GroEL0
[0009]更进一步地，所述鸡白痢沙门氏菌重组蛋白GroEL是由原核表达载体pET-28a-GroEL表达的，原核表达载体pET-28a_GroEL是由以下方法构建而成的:
[0010]I)设计一对含有酶切位点的特异性引物:
[0011]GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamH I ；
[0012]GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC Xho I ；
[0013]2)利用上述特异性引物，以鸡白痢沙门氏菌基因组为模板，扩增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pET-28a原核表达载体进行酶切，用T4DNA连接酶将扩增片段的酶切产物连接到pET-28a酶切产物上，构建pET-28a-GroEL载体，转化大肠杆菌DH5 α感受态中，经酶切鉴定和测序鉴定，表明重组原核表达载体pET-28a-GroEL构建成功。
[0014]进一步地，所述试剂盒内设有:封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液。[0015]封闭液为PBST配制5%脱脂奶粉；样品稀释液为I XPBS ;洗涤液为PBST ;显色液为IOOmmol柠檬酸钠溶液24.3mL,200mmol磷酸氢二钠25.7ml，加入50mg TMB,临用前加入50微升30%H202配制；终止液为2M浓硫酸。
[0016]本发明还提供了所述试剂盒的使用方法:
[0017]将待检血清或者蛋黄液按1:100比例经PBS稀释后加入抗体检测板中，每孔100 μ L，并同时设立好阴、阳性对照，37°C作用I小时；接着PBST洗三遍；用PBS将辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG抗体按1:5000稀释，每孔100 μ L加入反应板中，37°C作用30分钟；接着PBST洗三遍；按每孔加入100 μ L显色液，37°C作用约15分钟后加入2M硫酸终止液终止反应，最后通过酶标仪检测，阴性平均值+2.58SD为临界值，大于临界值判为阳性，反之为阴性。
[0018]本发明还提供了 一种表达鸡白痢沙门氏菌重组蛋白GroEL的载体。
[0019]进一步地，所述载体为原核表达载体，是由以下方法构建而成的:
[0020]I)设计一对含有酶切位点的特异性引物:
[0021]GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamH I ；
[0022]GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC Xho I ；
[0023]2)利用上述特异性引物，以鸡白痢沙门氏菌基因组为模板，扩增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pET-28a原核表达载体进行酶切，用T4DNA连接酶将扩增片段的酶切产物连接到pET-28a酶切产物上，构建pET-28a-GroEL载体，转化大肠杆菌DH5 α感受态中，经酶切鉴定和测序鉴定，表明重组原核表达载体pET-28a-GroEL构建成功。
[0024]本发明的有益效果在于:
[0025]本发明通过免疫沉淀技术筛选出鸡白痢沙门氏菌优势抗原GroEL，该抗原具有良好的特异性和敏感性，可用于鸡蛋和血清中鸡白痢沙门氏菌抗体检测，可以大大减少鸡的应激，提高经济效益，提高工作效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明实施例1中鸡白痢阴、阳性血清纯化IgG ；
[0027]其中，A为鸡白病阳性血清纯化IgG，M:蛋白分子量标准；1:纯化如；2:纯化后；B为鸡白痢阴性血清纯化IgG，M:蛋白分子量标准；1:纯化后；2:纯化前。
[0028]图2为本发明实施例1中免疫沉淀技术筛选鸡白痢沙门氏菌优势抗原；A为SDS-PAGE电泳图；B为肽指纹图谱分析图；
[0029]其中，M:蛋白分子量标准；1:鸡阴性血清(纯化后IgG);2:鸡白痢沙门氏菌阳性血清(纯化后IgG) ；3:鸡白痢沙门氏菌抗原复合物；4:beads+兔抗鸡IgG 二抗+鸡白痢沙门氏菌抗原复合物；5:beads+兔抗鸡IgG 二抗+鸡阴性血清(纯化后IgG) +鸡白痢沙门氏菌抗原复合物；6:beads+兔抗鸡IgG 二抗+鸡白痢沙门氏菌阳性鸡血清(纯化后IgG) +鸡白痢沙门氏菌抗原复合物。
[0030]图3为本发明实施例2中鸡白痢沙门氏菌基因组电泳鉴定图；
[0031]其中，M:基因组分子量标准XDNAHind III ；1:鸡白痢沙门氏菌基因组DNA。
[0032]图4为本发明实施例2中鸡白痢沙门氏菌GroEL基因扩增片段的电泳鉴定图；[0033]其中，M:DNA分子量标准；1:鸡白痢沙门氏菌GroEL基因扩增片段。
[0034]图5为本发明实施例2中pMD19-T_GroEL连接产物的双酶切电泳鉴定图；
[0035]其中，A =GroEL基因PCR鉴定；M:DNA分子量标准；I =GroEL基因；B:pMD19-T-GroEL双酶切鉴定；M:DNA分子量标准；1:空载质粒双酶切前；2:pMD19-T-GroEL质粒双酶切后。
[0036]图6为本发明实施例2中pET-28a_GroEL连接产物的双酶切电泳鉴定图；
[0037]其中，A =GroEL基因PCR鉴定；M:DNA分子量标准；I =GroEL基因；B:pET-28a-GroEL双酶切鉴定；M:DNA分子量标准；1:空载质粒双酶切前；2:pET-28a-GroEL质粒双酶切后。
[0038]图7为本发明实施例3中原核表达载体的转化与诱导表达SDS-PAGE电泳图；
[0039]其中，M:蛋白分子量标准；1:诱导前空载体；2:诱导后空载体；3:含pET-28a-GroEL质粒的BL21基因工程菌诱导前表达细菌总蛋白；4:含pET-28a_GroEL质粒的BL21基因工程菌诱导后表达细菌总蛋白。
[0040]图8为本发明实施例3中GroEL重组蛋白的蛋白印迹鉴定；
[0041]其中，A =His单克隆抗体检测；1 =GroEL-His重组蛋白；2:空载体诱导对照；B:鸡白痢阴性血清(鸡场采集)检测；3 =GroEL-His重组蛋白；4:空载体诱导对照；C:鸡白痢阳性血清(鸡场采集)检测；5:空载体诱导对照；6 =GroEL-His重组蛋白。
[0042]图9为本发明实施例3中GroEL重组蛋白的纯化中SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析；
[0043]其中，M:蛋白分子量标准；1:含pET-28a_GroEL质粒的BL21基因工程菌诱导表达细菌总蛋白；2:穿透液蛋白；3:洗脱液蛋白；4:纯化的GroEL-His蛋白。
【具体实施方式】
[0044]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0045]实施例1免疫沉淀(pulldown)技术筛选鸡白痢沙门氏菌优势抗原
[0046]I平板凝集实验
[0047]取10 μ L鸡白痢、鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原滴于一块干净的玻片上，接着取10 μ L鸡场采集的血清滴于该玻片上，上下颠倒进行充分混合，2min内出现凝集颗粒，液体清亮判为阳性，不出现凝集颗粒则判为阴性，以SPF鸡为阴性对照。分别鉴定出鸡白痢阴、阳血清用于免疫沉淀。
[0048]2鸡白痢阴、阳性血清纯化IgG
[0049]2.1透析袋处理:取200ml溶液I (用蒸馏水配制，含2% (W/V)碳酸氢钠、ImmolEDTA,氢氧化钠调pH为8.0构成)于烧杯中,将烧杯置于水浴锅内煮沸,接着将一定长度的透析袋放入溶液I中缓慢搅动，IOmin后取出烧杯自然冷却，接着用蒸馏水彻底冲洗透析袋7-8次；下一步取200ml溶液II (蒸馏水配制ImmolEDTA，氢氧化钠调pH为8.0)于烧杯中，操作同上。
[0050]2.2分别取经过平板凝集实验鉴定的鸡白痢阴、阳性血清300 μ L加入2ml EP管，接着加入等体积300 μ L灭菌生理盐水充分混匀。逐滴加入饱和硫酸铵溶液600 μ L使其饱和度达到50%，室温放置30min，4°C、12000rpm，离心IOmin弃上清。加入Iml灭菌生理盐水溶解沉淀，再次逐滴加入饱和硫酸铵溶液538 μ L使其饱和度达到35%，室温放置30min，4°C、12000rpm，离心IOmin弃上清。加入Iml灭菌生理盐水溶解沉淀，重复上述操作。最后离心20min,尽量弃掉上清。加入300 μ L灭菌生理盐水溶解沉淀,装入透析袋中，4°C透析24h，当中换液数次、用1%氯化钡溶液检测透析效果。鸡白痢阴、阳性血清纯化IgG前后的蛋白质分子量见图1。
[0051]透析完毕测定IgG浓度，测定结果为25 μ g/μ L。之后取少量抗体，加入6 X SDS上样缓冲液煮沸IOmin进行SDS-PAGE，检测纯化IgG纯度。
[0052]检测纯化IgG纯度是因为免疫沉淀要求用到的抗体具备良好的纯度，鸡场采集的血清含有很多非IgG成分，容易影响免疫沉淀的结果，通过SDS-PAGE可以清楚看到除了 IgG重轻链外，较少其他杂蛋白，达到免疫沉淀的要求。
[0053]3鸡白痢沙门氏菌抗原复合物的制备
[0054]取10 μ L鸡白痢沙门氏菌标准株533甘油菌加入到5ml LB液体培养基活化过夜，接着全部转入200ml LB液体培养基37°C振摇培养过夜，4°C、5000g/min离心5min收集菌体，用20ml灭菌PBS清洗菌体、离心弃上清。用IOml灭菌PBS重悬菌体，对收集的菌体进行超声裂解，裂解条件为:4°C冰浴，槽温40°C，间断超声，工作2s、间歇3s，共1800s，功率为35%。接着12000g/min，离心20min，弃沉淀、收集上清，测定蛋白浓度，测定结果为20 μ g/μ L，将鸡白痢沙门氏菌抗原复合物保存于_80°C用于免疫沉淀。
[0055]4免疫沉淀探寻鸡白痢沙门氏菌蛋白抗原
[0056]4.1protein A/G beads 处理
[0057]取500 μ L25%protein A/G beads4°C、3000rpm 离心 3min 弃上清；加入 2M 盐酸狐至lml4°C颠倒孵育30min-lh ；4°C>3000rpm离心3min弃上清；加入灭菌水500 μ L重悬beads, 4°C >3000rpm离心3min弃上清，重复该步骤3次。接着加入Lysis Buffer500 μ L重悬 beads, 4°C颠倒孵育 Ih ；4°C >3000rpm 离心 3min 弃上清；加入 Lysis Buffer500 μ L 重悬beads, 4°C >3000rpm离心3min弃上清，重复该步骤2次；最后加入Lysis Buffer500 μ L重悬beads,保存于4°C。
[0058]4.2beads、兔抗鸡IgG、鸡白痢阴阳性血清(纯化后IgG)偶联物制备
[0059]取50μ Lbeads、60y L兔抗鸡IgG、200y L鸡白痢阳性血清(纯化后IgG)加入1.5mlEP管，之后加入690 μ L Lysis Buffer混勻，4°C颠倒孵育8h ;按相同操作取50 μ L beads、60 μ L兔抗鸡IgG、200 μ L鸡白痢阴性血清(纯化后IgG)进行偶联；同时取50 μ Lbeads、60 μ L兔抗鸡IgG，4°C颠倒孵育4h偶联作为对照。
[0060]4.3 免疫沉淀(pulldown)实验
[0061]取鸡白痢沙门氏菌抗原复合物解冻，将990μ L上清转移到1.5mlEP管中，分为3管，其中每管加入10 μ L beads4°C颠倒孵育4h，4°C、3000rpm离心3min，将900 μ L上清转移到新的1.5ml EP管中；分别将偶联好的beads、兔抗鸡IgG、鸡白痢阳性血清(纯化后IgG)复合物，beads、兔抗鸡IgG、鸡白痢阴性血清(纯化后IgG)复合物，beads、兔抗鸡IgG复合物加入到该EP管内，并加入15 μ L蛋白酶抑制剂，4°C颠倒孵育8h。4°C、3000rpm离心3min，小心弃上清；向其中加入ImlLysis Buffer轻轻重悬复合物,4°C、3000rpm离心3min弃上清，如此重复洗涤4-6次。最后离心完全弃掉上清，加入40 μ LI X SDS上样缓冲液煮沸lOmin，之后12000rpm离心5min。同时取20 μ L鸡白痢沙门氏菌抗原复合物、按1:20稀释的鸡白痢鸡白痢阴、阳性血清(纯化后IgG)分别加入6XSDS上样缓冲液煮沸lOmin。
[0062]4.4SDS-PAGE 电泳、染色、脱色
[0063]所有配方参考《分子克隆三》配制12%蛋白胶，电泳时将4.3煮过的样品都分别加到一个孔内，然后再加一个蛋白分子量标准，开始以80V电压进行电泳，当样品进入分离胶后调为160V电压,直到IOkDa蛋白带在胶最下缘时停止。值得注意的是pull down实验后所有蛋白胶、染色、脱色溶液均应使用超纯水配制，在取胶、染色、脱色时均应戴上一次性塑料手套和口罩，所有器皿用浓硫酸泡过，防止蛋白污染。
[0064]4.5目的蛋白切割及保存
[0065]Pull down实验后通过SDS-PAGE染色、脱色发现有目的蛋白(见图2A)，首先利用凝胶成像系统拍下照片，接着戴好手套、口罩，将蛋白胶用超纯水洗涤两遍，用新的手术刀片切下目的条带，放到干净的进口 1.5mlEP管内。每条特异条带放入一个EP管内，之后装到自封袋内，做好标记暂时冻存于_20°C。将目的蛋白条带送到中国科学院生物物理所进行肽指纹图谱分析(见图2B)，将分析得到的数据放到数据库进行比对，确定得到目的蛋白为GroEL蛋白。
[0066]实施例2鸡白痢沙门氏菌GroEL原核表达载体的构建
[0067]I鸡白痢沙门氏菌全基因组的提取
[0068]取鸡白痢沙门氏菌标准株533甘油菌10 μ L接种5mlLB液体培养基，37°C振摇过夜。
[0069]按照细菌基因组DNA快速提取试剂盒说明操作:取2ml培养菌液，IOOOOrpm,离心30s，尽可能的吸弃上清，收集菌体。加入200 μ L缓冲液RB重悬，IOOOOrpm离心30s，弃上清。将细胞振荡重悬于180 μ L缓冲液RB。加入20 μ L蛋白酶K (20mg/ml)，充分混匀，再加入200 μ L结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70°C放置lOmin。冷却后加入100 μ L异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将上一步混合物加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心30_60s，倒掉收集管中的废液。加入500 μ L抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。加入700 μ L漂洗液WB (加入无水乙醇)，12000rpm离心30s,弃掉废液。加入500 μ L漂洗液WB, 12000rpm离心30s,弃掉废液。将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加60μ L洗脱缓冲液EB (洗脱缓冲液事先在65-70°C水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rpm离心lmin。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min, 12000rpm离心lmin。
[0070]制备1%的琼脂糖凝胶，取5 μ L DNA溶液与6 XDNA上样缓冲液混合后上样电泳，20min后观察并记录实验结果(见图3)。剩余DNA溶液存放_20°C。
[0071]2鸡白痢沙门氏菌基因GroEL的克隆
[0072]根据GenBank上登陆的GroEL系列,用Primer5.0设计特异性引物扩增GroEL基因片段。
[0073]上游引物GroEL-F: 5’ -CGCggatcc ATGGCAGCTAAAGACGTA-3’，含 BamH I 酶切位点；
[0074]下游引物GroEL-R:5’-CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC-3’，含 Xho I 酶切位点。
[0075]以鸡白痢沙门氏菌基因组为模板，建立50 μ L PCR反应体系:
[0076]
【权利要求】
1.一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内含有鸡白痢沙门氏菌抗原GroEL蛋白。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内设有:包被鸡白痢沙门氏菌抗原的抗体检测板，酶标抗体，阳性对照为鸡白痢阳性血清，阴性对照为鸡白痢阴性血清。
3.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体。
4.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述鸡白痢沙门氏菌抗原GroEL蛋白为纯化的鸡白痢沙门氏菌重组蛋白GroEL。
5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述鸡白痢沙门氏菌重组蛋白GroEL是由原核表达载体pET-28a-GroEL表达的，原核表达载体pET-28a_GroEL是由以下方法构建而成的: O设计一对含有酶切位点的特异性引物:
GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamH I ；
GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC Xho I ； 2)利用上述特异性引物，以鸡白痢沙门氏菌基因组为模板，扩增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性内切酶 ，分别对PCR扩增产物和pET-28a原核表达载体进行酶切，用T4DNA连接酶将扩增片段的酶切产物连接到pET-28a酶切产物上，构建pET-28a_GroEL载体，转化大肠杆菌DH5ci感受态中，经酶切鉴定和测序鉴定，表明重组原核表达载体pET-28a-GroEL 构建成功。
6.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内设有:封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法为: 将待检血清或者蛋黄液按I: 100比例经PBS稀释后加入抗体检测板中，每孔100 μ L，并同时设立好阴、阳性对照，37°C作用I小时；接着PBST洗三遍；用PBS将辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG抗体按1:5000稀释，每孔100 μ L加入反应板中，37°C作用30分钟；接着PBST洗三遍；按每孔加入100 μ L显色液，37°C作用约15分钟后加入2M硫酸终止液终止反应，最后通过酶标仪检测，阴性平均值+2.58SD为临界值，大于临界值判为阳性，反之为阴性。
8.—种表达鸡白痢沙门氏菌重组蛋白GroEL的载体。
9.根据权利要求8所述的载体，其特征在于，所述载体为原核表达载体，是由以下方法构建而成的: 1)设计一对含有酶切位点的特异性引物:
GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamH I ；
GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC Xho I ； 2)利用上述特异性引物，以鸡白痢沙门氏菌基因组为模板，扩增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pET-28a原核表达载体进行酶切，用T4DNA连接酶将扩增片段的酶切产物连接到pET-28a酶切产物上，构建pET-28a_GroEL载体，转化大肠杆菌DH5ci感受态中，经酶切鉴定和测序鉴定，表明重组原核表达载体pET-28a-GroEL 构 建成功。
【文档编号】C12N15/70GK103995126SQ201410158723
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】郑世军, 徐志超, 李晓齐, 王永强, 曹红 申请人:中国农业大学