源自棉铃虫的2-十三烷酮诱导型启动子的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种源自棉铃虫细胞色素CYP6B2基因的2-十三烷酮诱导型启动子序列和5’非翻译区，以及含有上述序列的真核细胞表达载体与细胞系。本发明的启动子和5’非翻译区，可用于真核基因的高效表达，用于获得低丰度基因研究，对棉铃虫植物次生性物质诱导型启动子的研究为研究害虫与植物次生物质的互作以及开发新型抗虫新品种奠定基础。
【专利说明】源自棉铃虫的2-十三烷酮诱导型启动子
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物次生物质诱导性启动子领域，具体地说，涉及源自棉铃虫细胞色素CYP6B2基因的2-十三烷酮诱导型启动子。
【背景技术】
[0002]棉铃虫(Helicoverpa armigera)是造成农业减产的重要害虫,其危害范围相当广泛，包括棉花、番茄、玉米、小麦、大豆、花生、水稻等60多种栽培作物和67种野生植物。
[0003]植食性昆虫以各种取食策略从寄主植物获取营养。但是植物并不是被动的受害者，会针对植食性昆虫产生植物次生性物质或防御蛋白，植物也会释放挥发性物质引诱捕食性天敌取食害虫。2-十三烷酮是广泛存在于茄科植物中的一种防御性植物次生物质，以野生番茄中含量为最高。番茄作为棉铃虫的寄主植物，前期研究发现番茄中含有的植物次生物质2-十三烷酮能够诱导棉铃虫中的解毒酶基因CYP6B2的高表达，这可能是棉铃虫利用2-十三烷酮作为化学感应信号来启动其防御机制进而应对2-十三烷酮胁迫的重要生理机能。
[0004]基因表达的调控在几个环节都有可能发生，涉及到DNA水平、转录水平、转录后水平、翻译水平以及翻译后水平的调控等，其中转录水平的调控是最普遍的调控方式。关于植物次生性物质诱导昆虫P450基因转录水平调控的研究主要集中在对其顺式调控元件和反式作用因子方面的研究，启动子上的顺式调控元件被认为在基因转录调节上发挥着重要作用，反式作用因子 与启动子上的顺式调控元件相互作用调控基因的表达。如在CYP6B家族基因启动子的XRE-AhR (异类芳香烃受体化合物应答元件)、AhR, XRE-Xan (花椒毒素应答元件)顺式调控元件具有较高的同源性，这类元件与有毒物质及植物次生性物质代谢相关，进一步说明了 CYP6B家族基因的表达与植物次生性物质的代谢调节具有密切关系。在北美黑条黄凤蝶中代谢呋喃香豆素的P450基因CYP6B4和CYP6B1中存在EcRE/ARE/XRE-xan元件，这些转录调控元件在花椒毒素或苯并芘诱导下调控CYP6B4基因的过量表达(Mcdonne C.M., Browna B.R., Berenbauma M.R., Schuler Μ.A., 2004.Conservedregulatory elements in the promoters of two allelochemical-1nducible cytochromeP450genes differentially regulate transcription.1nsect Biochemistry andMolecular Biology, 34(10):1129-1139.)。
[0005]因此，目的基因过量表达受基因转录活性的调节，其顺式调控元件可能调控目的基因的表达，这也显示出棉铃虫CYP6B2基因的启动子极可能具有较高的2-十三烷酮诱导活性，这类诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下，能够快速有效地诱导基因的转录，来抵御胁迫的影响。目前，分离和鉴定的棉铃虫植物次生性物质诱导型启动子并不多。对于新的高活性的棉铃虫植物次生物质相关启动子的克隆及诱导活性的鉴定，对进一步确定棉铃虫中与植物次生物质2-十三烷酮有关的转录元件及转录因子的研究具有重要意义，由于植物次生性物质是决定昆虫能否取食某种植物的主要因子之一，因此对棉铃虫植物次生性物质诱导型启动子的研究为研究害虫与植物次生物质的互作以及开发新型抗虫新品种奠定基础。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种来源于棉铃虫细胞色素P450CYP6B2基因的植物次生物质2-十三烷酮诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因闻水平表达。
[0007]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种2-十三烷酮诱导型启动子，所述启动子序列包含相对于SEQ ID N0.1的转录起始位点的-1bp至_2179bp区的DNA核苷酸序列。
[0008]进一步地，所述启动子序列源自棉铃虫细胞色素CYP6B2基因。
[0009]本发明还提供一种棉铃虫细胞色素CYP6B2基因的5’非翻译区，所述5’非翻译区包含相对于SEQ ID N0.1的转录起始位点的+Ibp至+41bp区的DNA核苷酸序列。[0010]本发明还提供含有前述启动子序列和前述5’非翻译区序列的真核细胞表达载体。
[0011]进一步地，所述载体为用于真核细胞转染的诱导型载体。
[0012]在本发明实施例中，本发明用于真核细胞转染的诱导型载体为pGL4.1-proCYP6B2，所述棉铃虫CYP6B2的启动子和5’非翻译区在表达载体中位于载体上外源报告基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述棉铃虫CYP6B2基因的启动子和5’非翻译区至含有Luciferase报告基因的载体(pGL4.lbasic)中而构建的pGL4.l_proCYP6B2。但是,所述Luciferase报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。
[0013]本发明还提供含有前述载体的细胞系。
[0014]作为优选，所述细胞系为植物次生物质诱导型瞬时表达的棉铃虫脂肪体细胞系。也可以用其他类似昆虫细胞系代替。
[0015]本发明还提供一种含有2-十三烷酮诱导型启动子的基因序列，所述基因序列如SEQ ID N0.1 所示。
[0016]本发明还提供用于扩增包含SEQ ID N0.1序列的DNA片段的PCR引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
[0017]本发明还提供前述启动子或前述基因序列在真核细胞中进行2-十三烷酮诱导表达中的应用。
[0018]本发明的有益效果在于:
[0019]本发明所述启动子序列可用于真核基因的高效表达，用于获得低丰度基因研究，对棉铃虫植物次生性物质诱导型启动子的研究为研究害虫与植物次生物质的互作以及开发新型抗虫新品种奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明所述的棉铃虫细胞色素CYP6B2基因的2_十三烷酮诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。
[0021]图2为本发明CYP6B2_pro PCR电泳图；
[0022]其中，M:DL15000+2000marker ；1~2:CYP6B2 基因的 5’ 侧翼区序列。
[0023]图3为本发明pGL4-CYP6B2_pro载体构建示意图。
[0024]图4为本发明CYP6B2_pro连pGL4.1basic酶切鉴定电泳图；[0025]其中，M:DL15000+2000marker ；1~2:pGL4.l-CYP6B2Pro 重组质粒经 MluI 和 XhoI双酶切电泳结果。
[0026]图5为本发明添加2-十三烷酮后CYP6B2_pro启动报告基因Luciferase活性的变化。
【具体实施方式】
[0027]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028]实施例1棉铃虫CYP6B2基因的2_十三烷酮诱导型启动子的克隆
[0029]棉铃虫CYP6B2的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID NO:1的转录起始位点的-1bp至-2179bp区的DNA核苷酸序列)，在棉铃虫CYP6B2基因的5’侧翼区序列中得到鉴定。
[0030]棉铃虫CYP6B2基因登录在NCBI GenBank (登录号:U18085.1)，序列表显示本发明上述基因的植物次生性物质2-十三烷酮诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。在本发明的启动子序列表中(见图1)，推测的转录起始位点(http://www.fruitfly.0rg/seq_tools/promoter, html)碱基A用+1示出,ATG用双下划线标出，TATA盒用波浪线标出。并用启动子分析网站(http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html#pmatch)分析了启动子的转录因子结合位点，其中一些重要的转录因子结合位点(Nrf2: MafK; Nrf2 )用下划线标出。以棉铃虫基因组DNA为模板，染色体步移法扩增得到目的基因CYP6B2的5’侧翼区序列，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度约为2500bp的条带(图2)，并进行回收。回收片段与PMD18-T载体连接得到重组质粒pMD18-T-CYP6B2Proh后进行测序，测序结果与CYP6B2基因序列进行比对，去除与CYP6B2基因序列重叠部分，得到CYP6B2基因5’侧翼序列，运用生物信息分析软件分析得出CYP6B2基因5’侧翼序列包含全长为2179bp的CYP6B2基因的启动子序列以及41bp的CYP6B2基因的5’非翻译区。图1显示棉铃虫细胞色素CYP6B2基因的2-十三烷酮诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列，在图1中，蛋白合成的起始密码子‘ATG’用双下划线标出，TATA盒用波浪线标出，转录起始位点的碱基‘A’用‘+I’标出，并加黑表示。
[0031]更具体地说，通过染色体步移法PCR扩增克隆得到2179bp的棉铃虫CYP6B2基因的启动子序列和41bp的5’非翻译区序列，扩增上述PCR产物所需引物详细显示在表1中。对于 PCR扩增，反应程序:95V 3min ；95°C 30S,52°C 30S,72°C 2min，32 个循环；72°C IOmin0
[0032]表1:引物
[0033]
【权利要求】
1.一种2-十三烷酮诱导型启动子，其特征在于，所述启动子序列包含相对于SEQ IDN0.1的转录起始位点的-1bp至-2179bp区的DNA核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子序列源自棉铃虫细胞色素CYP6B2 基因。
3.一种棉铃虫细胞色素CYP6B2基因的5’非翻译区，其特征在于，所述5’非翻译区包含相对于SEQ ID N0.1的转录起始位点的+Ibp至+41bp区的DNA核苷酸序列。
4.含有权利要求1所述启动子序列和权利要求3所述5’非翻译区序列的真核细胞表达载体。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为用于真核细胞转染的诱导型载体。
6.含有权利要求4或5所述载体的细胞系。
7.根据权利要求6所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为棉铃虫脂肪体细胞系。
8.一种含有2-十三烷酮诱导型启动子的基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQID N0.1 所示。
9.用于扩增包含SEQID N0.1序列的DNA片段的PCR引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
10.权利要求1或2所述的启动子或权利要求8所述的基因序列在真核细胞中进行2-十三烷酮诱导表达中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK103952409SQ201410158435
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】高希武, 张雷, 路瑶, 赵倩, 刘晓岚 申请人:中国农业大学