验材料如下：
[0025] 啤酒大麦：实施例中所用到的进口澳大利亚啤酒大麦Baudin、Commander、 Vlamingh由北京中粮集团公司提供，进口澳大利亚啤酒大麦Gairdner、Hindmarsh、 Schooner、FAQ由永顺泰麦芽公司提供；国产啤酒大麦苏啤3号、6号由江苏省盐城农科院 提供，垦啤7号、10号由黑龙江省农垦总局红兴隆农业科学研究所提供；所有啤酒大麦均为 2012-2013年度样品。
[0026]试剂与试剂盒：琼脂糖、溴酚蓝、碘乙酰胺（IAA)、二硫苏糖醇（DTT)、3_[ (3-胆固 醇氨丙基）二甲氨基]-1-丙磺酸（CHAPS)、Ν，Ν，Ν'Ν' -四甲基乙二胺（TEMED)、尿素、硫脲 为GE公司产品。矿物油、IPG胶条（pH3~10,17cm，非线性）、载体两性电解质（pH3~ 10,非线性）为Bio-Rad公司产品。α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA)、碳酸氢铵、三氟乙酸 (TFA)、膜蛋白酶、乙臆等购于Sigma公司。RNAisoPluskit、0nestepSYBRPrimeScript PLUSRT-PCRKit、10XDNaseIBufTer、RNaseinhibitor、RecombinantDNaseI等试剂购 于大连宝生物工程有限公司。DEPC试剂、30%丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠（SDS)、过硫酸铵 (APS)、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、牛血清蛋白、Tris、蛋白标准物为上海生工进 口分装产品。无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、乙酸钠、三氯乙酸（TCA)、乙二胺四乙酸（EDTA) 等为分析纯产品，购于国药集团试剂公司。
[0027] 实施例1~实施例3实验中所使用引物序列如表1所示。
[0028] 表1本发明所用到的引物序列
[0029]
[0030] 实施例1蛋白质组学技术发掘啤酒大麦Gairdner品种标志蛋白
[0031] 1.啤酒大麦种子醇溶蛋白的分级提取和双向电泳分离
[0032] 根据四分法，取20粒啤酒大麦种子，经粉碎机处理结合液氮研磨至粉末状，称取 3g粉末先后经过去离子水、5% (W/V)、NaCl及75% (V/V)乙醇抽提，得到大麦醇溶蛋白，具 体详见图1。
[0033] 采取TCA-丙酮法沉淀蛋白，即向蛋白上清液中加入4倍体积20 %的预冷的 TCA-丙酮溶液，摇匀，-20兴：过夜放置沉淀蛋白，4SC12000Xg离心30分钟。弃上清，收集 沉淀，用预冷的90 %丙酮清洗沉淀，4&C7800Xg离心30分钟，重复3次，沉淀自然挥发丙 酮，即得醇溶蛋白。将醇溶蛋白溶解于适量的蛋白水化液（8mol/L尿素、2mol/L硫脲、4% (W/V)CHAPS、0.8% (W/V)两性电解质及1% (W/V)DTT)，并测定蛋白质浓度。
[0034] 选用长度17cm的IPG胶条（pH3~10,非线性），蛋白样品（500~800μg)加入 水化液至终体积350μL，水化12~14h后，将胶条转移至等电聚焦仪EttanIPGhor3的聚 焦槽中，胶面朝上两端加上润湿的电极纸片，在胶条上面覆盖上矿物油进行密封，设置好聚 焦程序（表2)进行等电聚焦。等电聚焦完成后，利用两步平衡法进行胶条平衡：平衡液母 液（尿素 180g，甘油 150mL，SDS10g，溴酚蓝 0·lg，用 100mL0· 5molL1 的Tris-HCl(pH6. 8) 稀释至500mL)+l%DTT(W/V)，15分钟；平衡液母液+1. 25%IAA(W/V)，15分钟。胶条平 衡后转移至配置好的12. 5%丙烯酰胺凝胶上，用0. 5%琼脂糖封住凝胶上部，进行第二向 SDS-PAGE电泳：2W/gel电泳1小时后，14W*gel1至溴酚蓝指示剂迀移到凝胶底部时，关闭 电源，结束电泳。剥离凝胶，置于考马斯亮蓝G-250染色液中染色过夜，置脱色液（3%冰醋 酸）中脱色（约5~8h)，直到背景无色透明，蛋白点清晰为止。
[0035] 表2等电聚焦程序
[0036]
[0037] 2.双向电泳图谱分析及共同/差异蛋白的质谱鉴定
[0038] 利用TOQuest凝胶分析软件比较得到的各大麦醇溶蛋白双向电泳图谱（图2-图 4)，找到共同蛋白点及各大麦品种凝胶图谱上的特异蛋白点。通过切点、脱色、胶内胰酶酶 解，将酶解液点于质谱样品板，与基质混合后，利用基质辅助激光解吸的时间飞行质谱进行 肽段分离及二级裂解分离，得到肽指纹图谱后，与NCBI数据库比对，得到鉴定结果。其中 在Gairdner品种的谱图中特异的蛋白点，经鉴定分别为醇溶蛋白B(HordeinB)、α-淀粉 酶/膜蛋白酶抑制剂CM16(a-amylase/trypsininhibitorCM16)和α-淀粉酶抑制剂 BMAI-1(a-amylaseinhibitorBMAI-1)〇 〇
[0039] 实施例2Gairdner品种标志蛋白BMAI-1与其纯度的相关性曲线的构建
[0040] 1.人工混种
[0041] 取Gairdner、苏啤6号、垦啤7号大麦种子，以20粒种子混合，得到纯度分别为 100%、95%、90%、85%、80%、70%和 60%的混合大麦。
[0042] 2.种子总RNA的提取与纯化
[0043] 将混和大麦种子放入液氮冷冻，迅速转移至液氮预冷的研钵中，研磨至粉末状后 立即转入预冷的离心管中，利用宝生物公司的RNA提取试剂盒（RNAisoPlusKit)提取RNA， 具体步骤如下：
[0044] (1)加入适量RNAisoPlus，充分混勾，室温（15-30SC)静置5分钟；
[0045] (2) 12000Xg4ec离心5分钟，小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉 淀）；
[0046] (3)加入1/5体积的氯仿，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5分钟；
[0047] (4) 12000Xg4SC离心15分钟，此时液体分为三层：无色的上清（含RNA)、白色的 中间层（含蛋白和DNA)、有色的有机相。吸取上清至新的离心管。
[0048] (5)加入0. 5-1倍体积的异丙醇，充分混匀后，室温静置10分钟；
[0049] (6) 12000Xg4SC离心10分钟，沉淀即为总RNA，加入等量的75%乙醇，轻轻上下 颠倒清洗RNA;
[0050] (7) 7500Xg4sc离心5分钟，弃上清，室温干燥；
[0051 ] (8)加入适量DEPC水溶解RNA。
[0052] 提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳确定为RNA，为减小实验误差，对提取的RNA进行纯 化，去除基因组DNA，具体步骤如下：
[0053] (1)在微量离心管中配置反应液（表3)
[0054] 表 3
[0055]
[0056] (2)将反应管置于37SC反应30分钟；
[0057] (3)向反应体系中加入2. 5yL0· 5mol/LEDTA，混匀，80sc热处理2分钟，使 RecombinantDNaseI失活，加DEPC水定容至 100μL;
[0058] (4)加入10μL3mol/L醋酸钠和250μL冷乙醇，混匀后-80SC冷却20分钟；
[0059](5) 10000父84 2(：离心10分钟，弃上清，沉淀用70%冷乙醇洗涤，10000\8 4 2(： 离心5分钟，弃上清。
[0060] (6)室温挥发乙醇，用适量DEPC水溶解沉淀RNA，进行琼脂糖凝胶电泳确认是否完 全去除基因组DNA，利用NanoDropND-1000分光光度计测定各样品RNA浓度，RNA样品贮存 于-80ec待用。
[0061] 3. qRT-PCR及标志蛋白基因相对表达量的确定
[0062]qRT-PCR反应体系为 20yL，根据OneSt印SYBRPrimeScriptPLUSRTPCR试剂 盒配置体系，每个样品做三个平行反应管（表4):
[0063]表 4
[0064]
[0065] 所用引物如表1所示
[0066]qRT-PCR反应在CFX96Touch?Real-TimePCR仪上完成，反应程序为