一个猪6号染色体上用于溯源的snp分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属食品安全领域，具体涉及一个猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记 及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着社会的发展，食品供应链中的环节在不断增加，从农场、牧场到食品企业的加 工、包装、储藏、运输和销售，食品供应的各个环节存在食品的安全隐患，食品安全问题常有 发生。因此需要进行肉制品的可追溯管理，建立从产地到餐桌的各个环节的追溯体系，从而 为消费者提供准确而详细的有关产品的信息，有利于生产经营者及时发现各环节中存在的 不安全隐患。从20世纪90年代中期的食品安全危机开始，肉产品的追溯已经作为一种安 全控制措施，受到世界多个国家的高度重视。肉产品追溯系统加强了政府部门对肉产品质 量安全的监管能力，因此许多国家纷纷建立肉产品追溯系统用以降低肉产品质量安全中存 在的风险。
[0003] 肉产品溯源技术有标签溯源技术、同位素溯源技术、矿物元素指纹溯源技术、有机 物溯源技术虹膜特征技术和DNA标记溯源技术（或DNA溯源技术）等，其中DNA溯源技术因 为检测手段简单、快速、难以伪造等特点成为世界各国广泛应用的快速溯源技术。与其他标 记方法相比，DNA标记具有特有放入优越性：它直接以DNA形式出现，在生物体的各个组织、 各发育时期均可检测到，不受环境因素的影响，并且标记数量多，遍及生物体整个基因组。
[0004] SNP标记是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，一般表现为二等位基因，适宜 高通量自动化分析，所以成为动物身份识别最受关注的分子标记。
[0005] 但是用于肉产品溯源的SNP标记不同于一般的SNP标记，对于单个的SNP标记，它 必须至少具有以下特征：（1)变异度高，在品种或品系中等位基因频率接近；(2)品种间等 位基因分布频率差异小；（3)杂合度大于等于0. 3。
[0006] 在长期的育种工作中，研究者积累了大量的SNP标记，由于单个SNP溯源标记是无 法完成溯源的，因此，需要一组相互独立的SNP标记才能实现溯源。以现有的13个已知SNP 分子标记作为溯源标记组合，在经过高度选择引进的猪群体中，使用该组标记进行溯源时， 会出现某些个体不能区分的情况。
[0007] 另外，在长期的育种工作中，积累的大量的SNP标记往往集中分布在某些染色体 上，而另外部分染色体，如5号，6号，8号，14号，15号和18号染色体等则缺乏SNP标记，容 易导致分子标记间出现连锁现象，分子标记之间不能互相独立，缩小溯源实验的检测范围， 导致实际可检测范围小于预期可检测范围。因此，为了满足对猪肉产品进行DNA溯源的要 求，需要开发其他染色体上用于溯源的SNP标记，提高溯源检测范围及准确度。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一个猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记及其应用， 可以广泛用于猪肉产品DNA溯源，特别是用于猪肉产品的安全性溯源，完善了现有标记组 合，提高溯源检测准确度，扩大溯源规模。
[0009] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0010] 猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记，该SNP分子标记的DNA序列如SEQID NO. 1所示，共570bp，且第403位碱基处有一个碱基替换，为403T或403G，其DNA序列如SEQ IDNO. 1 所示。
[0011] 进一步，所述的SNP分子标记由Hinfl限制性内切酶识别。
[0012] 所述的SNP分子标记是通过NCBI数据库序列比对获得的，并在包括10个猪品种 或品系的试验群体（共计245个个体）中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的 分布情况，发现该分子标记在不同的品种和品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种 或品系间等位基因频率分布差异小，初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。
[0013] 所述的用于猪肉DNA溯源的SNP分子标记的获得方法，采用PCR-Hinfl-RFLP方法 进行，包括以下步骤：
[0014] (1)在NCBI上搜索猪6号染色体的DNA序列信息，设计正、反向引物分离猪6号染 色体的DNA片段；
[0015] ⑵利用NCBI数据库在线进行序列比对，寻找存在碱基替代的位点；
[0016] (3)PCR-Hinfl-RFLP检测方法的建立及替换位点的检测；
[0017] (4)采集10个品种和品系的耳组织样，共计245个个体；
[0018] (5)检测SNP分子标记在试验群体的分布，统计分析，并进一步试验验证是否适用 于猪肉产品溯源中。
[0019] 其中，上述检获得SNP分子标记的方法中，所述的分离猪6号染色体上DNA片段的 正、反向引物序列如下：
[0020] 正向引物：5' -CCCTTGCCATTATCTCAC-3'（如SEQIDN0. 2 所示）；
[0021] 反向引物：5' -ATTTGTTCTTTACACTCAGCA-3'（如SEQIDNO. 3 所示）。
[0022] 在DNA溯源过程中，每增加一个溯源位点，就能进一步扩大检测样本的数目，准确 性也就更高，理想的SNP位点应该是均匀分布在猪不同的染色体上，而现有的SNP位点中缺 乏6号染色体上的溯源标记。
[0023] 本发明通过NCBI数据库序列比对检测到猪6号染色体上的存在的SNP分子标记， 在包括10个猪品种或品系的试验群体中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分 布情况，发现该分子标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或 品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0. 3,初步判定该SNP标记可用作猪肉 产品DNA溯源以及猪肉产品的安全性溯源中。
[0024] 为了完善已有SNP分子标记组合，提高溯源实验的检测准确度，扩大溯源规模，将 本发明获得的猪6号染色体上的新SNP分子标记位点与其它现有已公开的SNP分子标记位 点结合在一起（共计14个SNP位点）进行溯源实验。
[0025] 本发明在溯源实验中，增加商品猪来源，在屠宰场共挑选了来自不同猪场的300 个个体，从300个个体中随机挑选100个个体，检测该100个个体中14个SNP位点的基因 型，统计每个个体的基因型结果，发现100个个体均拥有各自不同的基因型，能实现个体区 分；同时，随机在这100个个体中挑取20份肌肉样，同样检测统计14个SNP分子标记位点 的基因型，然后跟100个个体的基因型进行比对分析，发现均能找到与20份肌肉样品基因 型完全一致的个体，即通过溯源在100个个体中找到20份猪肌肉的来源个体，因此判定本 发明的该SNP分子标记可以用于猪肉产品溯源。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0027] 本发明的SNP分子标记位于猪的6号染色体上，能进一步完善标记的检测覆盖面， 提高溯源的准确性，并扩大已有分子标记的检测范围。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
[0029] 实施例1分子标记的查找
[0030] (1)引物设计
[0031] 以猪6号染色体的DNA序列（Genbank:FN673773)为模板，设计引物分离猪的DNA 片段（以一头申农猪的DNA为PCR扩增的模板），引物如下：
[0032]正向引物：5' -CCCTTGCCATTATCTCAC-3'（如SEQIDN0. 2 所示）
[0033]反向引物：5' -ATTTGTTCTTTACACTCAGCA-3'（如SEQIDNO. 3 所示）
[0034]PCR反应总体积为20μ1，其中猪基因组DNA约100ng，含lXbuffer(Promega公 司），1. 5mmol/LMgCl2,dNTP(上海生工生物公司）终浓度为150ymol/L，引物终浓度为 0· 2μmol/L，2UTaqDNA聚合酶（Promega公司）。
[0035] PCR扩增：94°C4min，（94°C30s，59°C退火 30s，72°C30s)循环 30 次，最后 72°C延 伸 10min〇
[0036]PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检 测。
[0037] (2)克隆测序分析
[0038] 将得到的猪6号染色体的DNA片段按照如下方法进行克隆。
[0039]PCR产物的纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝