胶上切下含目的片段的凝胶，放入1. 5ml Ependorff管中，用PCR产物纯化试剂盒（天根生化科技有限公司）纯化。
[0040] 连接反应：将纯化的PCR产物与PMD18-T载体（大连宝生物公司）连接，连接反应 总体积是1〇μ1，其中包括5μ1solutionI(大连宝生物公司），0·5μ1的T载体（大连宝 生物公司），2. 5μ1的纯化PCR产物，最后加入2μ1灭菌水置4°C水浴过夜。
[0041] 转化：无菌状态下取100-120μ1感受态细胞（天根生化科技有限公司）于1. 5ml Ependorff管中，将5μ1的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42°C热激90s，其间不要 摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μ1无抗生素的LB液体培养基，37°C平放 lh后倒置培养。
[0042] 菌落PCR鉴定：经菌落PCR鉴定后的菌株在LB培养基37°C培养过夜，随即挑取多 个克隆子送到上海生工生物有限公司测序。
[0043] 经测试，该经拼接后的猪DNA序列共570bp，位于猪的6号染色体上，序列如 SEQIDNO. 1所示。经分析发现其第403碱基处存在一个碱基替换，为403T或403G。 通过分子生物学软件分析和NCBI数据库分析，发现该第403碱基处的碱基替换导致 Hinfl-RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，即Hinfl-RFLP位点）多态性。
[0044] (3)PCR-Hinfl-RFLP检测方法的建立及替换位点的检测
[0045] 酶切反应总体积10μ1，其中lXbuffer10μ1，PCR产物3-5μ1，限制性内切 酶Hinfl为0. 5以1(511)，用Η20补足10μ1，37Γ水浴4h，称取0. 6g琼脂糖溶于15. 75ml DEPC(上海生工生物公司）处理水中，稍冷却后加入5ml的5X甲醛凝胶电泳缓冲液和 4. 25ml的37%甲醛溶液，混匀制胶，电泳后检测酶切结果。结果发现：SEQIDNO. 1序列中 A等位基因只有570bp-个片段，G等位基因有400bp和170bp两个片段，这两个等位基因 可组成三种基因型，GG，GT，TT。且在该SEQIDNO. 1序列的第403位碱基发生替换，碱基 为T或G。
[0046] 实施例2等位基因的分布情况
[0047] (1)试验群体的设计
[0048] 试验组：采集皮特兰（21头）、申农（17头）、大白（43头）、大申（52头）、长申（16 头）、杜申（23头）、皮大申（11头）、长大申（25头）、杜大申（17头）和杜皮大申（20头） 个体的耳组织，提取DNA，共计245个DNA样本。
[0049] 试验群体的目的在于检测SNP标记在不同品种中的分布情况。
[0050] (2)基因检测
[0051]正向引物：5' -CCCTTGCCATTATCTCAC-3'（如SEQIDN0. 2 所示）；
[0052]反向引物：5' -ATTTGTTCTTTACACTCAGCA-3'（如SEQIDNO. 3 所示）。
[0053] 进行扩增（条件如实施例1)，用相同的PCR-Hinfl-RFLP方法检测试验群体所有的 个体基因型。
[0054] (3)统计分析
[0055] 记录试验群体所有的个体基因型，并计算等位基因频率和杂合度，结果如下表1。
[0056]表1
[0057]
[0058] 从表1可知：本发明的SNP分子标记在各品种中的等位基因频率接近，多态性丰 富；品种或品系间，等位基因频率A和G的分布差异小；所有品种或者品系的杂合度Η均大 于〇. 3,因此初步认为该SNP标记可以用于猪肉产品的DNA溯源和安全性溯源中。
[0059] 实施例3SNP分子标记可用性溯源试验验证
[0060] 本发明的SNP分子标记已被初步证实可用于溯源性标记中，为了确保在溯源标记 中的可用性，本发明又在不同地点重新取样，与现有的13个SNP分子标记（如下述表2所 示）结合使用（共14个SNP分子标记），进行可用性溯源试验验证，同时，以仅用现有的13 个SNP分子标记进行溯源试验验证作对比例。
[0061] 在复兴屠宰场随机采集猪个体的耳组织和肌肉样各100份（每个猪个体均同时采 集耳组织样和肌肉样），耳组织样编号E1-E100,肌肉样编号M1-M100,分别提取肌肉样和耳 组织样品的DNA备用。
[0062] 在100个个体耳组织样中及随机挑选的20个肌肉样品中检测本发明的猪的Hinfl SNP位点与现有已公开的13个SNP位点的基因型（共计14个SNP分子标记位点），统计每 个个体的基因型结果。按照酶切带型，一条带记为1，出现两条带记为2,三条带记为3。记 录顺序按照表2位点顺序排列，如ADAMTS-1基因的PvuII酶识别的SNP分子标记位点为1， 其基因型记录结果就排在第一位，ADD1基因的Eamll04I酶识别的SNP分子标记位点为2， 其基因型记录结果就排在第二位，依次类推，本申请的猪6号染色体上的HinflSNP分子标 记位点排在最后，其基因型结果就表示为从左往右的第14个数字，个体的基因型可以表示 为：21232322223311 〇
[0063] 表 2
[0064]
[0065] 统计每个个体和肉样的14个SNP分子标记位点的基因型，100个个体和20份肌肉 样品的基因型统计对比结果分别如下表3和表4。
[0066] 在表3中，82号个体和91号个体的基因型非常相似，两个个体的前13位标记数值 均一致，唯一的区别在于第14位标记不同。由此可见，仅利用现有的13个SNP分子标记进 行溯源时，会出现基因型重复的情况，第14位标记为本发明提供的新SNP标记，说明加入本 发明的SNP分子标记后，就可以顺利将该两中基因型进行区分，本发明的新SNP分子标记的 加入进一步完善了溯源组合的溯源规模，提升了用SNP分子标记对猪肉DNA进行溯源的准 确性。
[0067] 把20份肌肉样的14个SNP分子标记位点的基因型结果跟该100个个体的基因型 进行比对分析（比对结果参看表4)，发现均能找到与该20份肌肉样品基因型完全一致的个 体，即通过溯源在100个个体中找到20份猪肌肉的来源个体，实现肉样到个体的准确溯源。
[0068] 结合表3和表4说明，利用14个SNP分子标记进行溯源试验，100个个体、20份肌 肉样用14个SNP分子标记检测均拥有不同的基因型，能实现个体区分。
[0069] 表 3
[0070]
【主权项】
1. 猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记，该SNP分子标记的DNA序列如SEQID NO. 1所示，共570bp，第403位碱基处有一个碱基替换，为403T或403G。2. 根据权利要求1所述的猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记，其特征在于，其由 Hinfl限制性内切酶识别。3. 用于扩增权利要求1所述的猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记的引物对，其 特征在于，其包括正向引物、反向引物，具体碱基序列如下： 正向引物：如SEQIDNO. 2所示； 反向引物：如SEQIDNO. 3所示。4. 权利要求1所述的猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记在猪肉产品DNA溯源中 的应用。
【专利摘要】本发明公开了一个猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记及其应用，所述的SNP分子标记是通过NCBI数据库序列比对获得的，该SNP分子标记由HinfI限制性内切酶识别，共570bp，第403位碱基处有一个碱基替换，为403T或403G，其序列如SEQ？ID？NO.1所示。通过在包括10个猪品种或品系的试验群体中分析SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现本发明的SNP分子标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0.3，该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105296639
【申请号】CN201510785854
【发明人】吴潇, 唐雪明, 武国干, 吕贝贝, 蒋玮, 王金斌, 李鹏, 白蓝, 刘华, 赵凯, 王荣谈
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月16日