SRAP结果，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显 性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯 度。
[0026] 本发明的检测方法在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时90min，SRAP分 析60-90min，所以本发明的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低 成本、操作方便等优势。其次SRAP标记是基于DNA基础的分子标记，不受环境限制和影响、 无表型效应，具有客观、稳定等特点。
【附图说明】
[0027] 图1为9对引物对"陇杂1号"、"陇杂2号"及其亲本自交系的SRAP检测结果。
[0028] 其中，泳道^1^1?51';泳道1-5所用引物是組0/^7，样品顺序 ：15，陇10,873，陇 杂2号，陇杂1号；泳道6-10,泳道11-15,泳道16-20,泳道21-25,泳道26-30,泳道31-35， 泳道36-40,泳道41-45样品顺序一致；9对引物分别是M10/E7, M10/E3, M1/E9, M4/E3, M3/ E2, M3/E16, M2/E5, M6/E6, M3/E10。图2为引物M10/E3对"陇杂1号"及其亲本自交系的 SRAP检测结果。
[0029] 其中，泳道I :1S母本；泳道2 :陇10父本；泳道3 :873父本；泳道4 :陇杂2号；泳 道5 :陇杂1号。
[0030] 图3为引物M2/E5对"陇杂2号"及其亲本自交系的SRAP检测结果。
[0031] 其中，泳道I :1S母本；泳道2 :陇10父本；泳道3 :873父本；泳道4 :陇杂2号；泳 道5 :陇杂1号。
[0032] 图4为引物M10/E3对"陇杂1号"及其亲本自交系的SRAP检测结果。
[0033] 其中，泳道M !Marker ;泳道1-2 : IS母本；泳道3-4 :873父本；泳道5-24 :"陇杂1 号" F1。
[0034] 图5为引物M2/E5对"陇杂2号"及其亲本自交系的SRAP检测结果。
[0035] 其中，泳道M :Marker ;泳道I :1S母本；泳道2-3 :陇亚10号父本；泳道4-24 :"陇 杂2号" F1。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1 :
[0037] 1、材料：
[0038] 亚麻品种试验所用的'陇杂1号'、'陇杂2号'及其父母本均来自甘肃省农科院作 物所胡麻课题组。
[0039] 2、引物和试剂：
[0040] 试验所用引物由北京金唯智生物技术有限公司合成，实验所用的Mg2+、Taq酶、 dNTPs和Buffer购自天根生物技术有限公司。
[0041] 用于鉴定陇杂1号种子纯度的SRAP引物组合M10/E3中，上游引物序列MlO : 5' -TGA GTC CAA ACC GGA AA-3'，下游引物序列 E3 :5' -GAC TGC GTA CGA ATT GAC-3'。
[0042] 用于鉴定陇杂2号种子纯度的SRAP引物组合M2/E5中，上游引物序列：M2:5'-TGA GTC CAA ACC GGA GC-3'，下游引物序列 E5:5' -GAC TGC GTA CGA ATT AAC-3'。
[0043] 3、方法：
[0044] 3. I DNA 提取：
[0045] 亚麻基因组DNA提取采用改良CTAB法，种子萌发后7天，单株采摘亚麻幼嫩幼苗 提取DNA，然后进行DNA溶液浓度与纯度检测，并将其稀释为30 ng/gL，-20°C下保存。
[0046] CTAB提取液的配制如表2所示。
[0047] 表 2
[0048]
【主权项】
1. 一种基于SRAP标记的亚麻杂交种种子纯度鉴定的方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 提取亚麻总基因组DNA ; 2) 利用SRAP引物组合M10/E3,以"陇杂1号"基因组DNA为模板进行PCR扩增，或利 用SRAP引物组合M2/E5，以"陇杂2号"基因组DNA为模板进行PCR扩增； 3) 将扩增后的DNA片段，利用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测SRAP扩增产物； 4) 对电泳结果进行分析，将同时具有双亲特异性标记条带的单株判定为真正的杂交 种，计算种子遗传纯度，计算方法为，通过计算供试种子样品中杂交种数量占总样品数量的 比例确定种子纯度。
2. 根据权利要求1所述的一种基于SRAP标记的亚麻杂交种种子纯度鉴定的方法，其特 征在于， 所述SRAP引物组合M10/E3序列为： 正向引物 M10 :SEQ ID No. 1 ; 反向引物 E3 :SEQ ID No. 2 ; 所述SRAP引物组合M2/E5序列为： 正向引物 M2 :SEQ ID No. 3 ; 反向引物 E5 :SEQ ID No.4。
3. 根据权利要求1或2所述的一种基于SRAP标记的亚麻杂交种种子纯度鉴定的方法， 其特征在于，所述SRAP-PCR反应体系的总体积为25 y L，体系包含10XPCR Buffer 2 y L、 25臟〇1/11%2+2 1^、2.5臟〇1/1(1阶138 3 1^、2.5。丁39酶0.5 1^、30叩/1^模板0嫩2 1^及 25ng/ y L引物各1 y L，其余用ddH20补足； PCR扩增程序为：94°C预变性3min，94°C变性45S，34. 5°C退火20S，72°C延伸60S，共5 个循环；然后，再94°C变性45S，50°C退火20S，72°C延伸60S，共38个循环；最后72°C延伸 10min，4°C 保存。
【专利摘要】本发明公开了一种基于SRAP标记的亚麻杂交种种子纯度鉴定的方法，是先提取亚麻总基因组DNA；然后利用SRAP引物组合M10/E3，以“陇杂1号”基因组DNA为模板进行PCR扩增，或利用SRAP引物组合M2/E5，以“陇杂2号”基因组DNA为模板进行PCR扩增；再将扩增后的DNA片段，利用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测SRAP扩增产物；最后对电泳结果进行分析，并计算种子遗传纯度。本发明提供的鉴定方法，具有以下优点：短期内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势；基于DNA基础的分子标记不受环境限制和影响、无表型效应，具有客观、稳定、快速、高效等特点。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104611415
【申请号】CN201410648783
【发明人】张建平, 党占海, 李闻娟, 王利民, 党照, 赵玮, 赵利
【申请人】甘肃省农业科学院作物研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年11月14日