植物油中动物源成分的lamp法检测引物和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学中用LAMP法对动物DNA的检测，特别涉及对多种动物所共有DNA序列检测的引物和用这种引物对多种动物共有DNA序列检测的方法。
[0002]
技术背景
[0003]检测植物油中的动物源成分的意义在于我国是世界上食用植物油消费量最大国家，每年的消费总量大约是2500万吨，废弃油脂量逐年上升，有些不法商人在利益驱动下，将烹饪后的废弃油(俗称潲水油)经加工后作为食用植物油销售。据专家用年消费总量减去每年国内食用植物油生产量和进口量推算，每年返回餐桌潲水油约有200-300万吨之多，这还是比较保守的数字，因此不可低估潲水油重返餐桌的全国规模及其造成后果的严重性。对潲水油进行检测鉴定是必须进行的一项公益性工作。目前，为进行此项工作，技术上的基本思路是:因纯植物油理论上不含动物源性成分，而潲水油因已进行食品加工处理，理论上含有动物源成分，据此研究人员开发各种生物或理化检测方法检测植物油中的动物源性成分来判断植物油中是否添加潲水油。
[0004]近年来，分子生物学先进检验技术开始应用于潲水油鉴别判断。潲水油通常是多种动、植物油脂的混合物，含有大量的动物油脂。因此可通过检测植物油中动物DNA来推断该植物油是否掺入潲水油。由于潲水油在精炼过程中，动物DNA会被严重降解，含量极低。研究表明，当肉加热到100°C时DNA片段锐减到IlOObp左右，而加热到120°C时减至600 bp以下。所以该法的关键之一在于开发高灵敏度的检测技术方法。目前，研究人员主要采用PCR和荧光定量PCR技术进行植物油中动物源成分检测，PCR技术方法的主要问题是:需较昂贵的检测设备，荧光定量PCR仪市场价格40-50万元；使用专用检测设备荧光定量PCR仪的操作较复杂；PCR技术检测的灵敏度稍显不足，我们的实验在10ml植物油中加入炒制的Ig动物肉，制成含动物源成分的植物油，使用荧光定量PCR方法无法检出。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种能比PCR技术检测动物源性成分费用更低、灵敏度更高的LAMP检测方法所用的引物，以及用这个引物在含动物源成份的植物油中高灵敏度的检测出动物源的检测方法。
[0007]本发明所说的5种畜禽是牛、猪、羊、鸡和兔。
[0008]本发明所说的动物肉含义是牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉和兔肉的某一种，或者其混含物。
[0009]本发明所说的动物源含义是牛肉DNA、猪肉DNA、羊肉DNA、鸡肉DNA和兔肉DNA的某一种，或者其混含物。本发明所说的动物源也可称为动物源DNA。
[0010]用本发明的引物的作用是，使用分子生物学LAMP检测方法，在植物油中如能检测出动物源DNA，可以作为该植物油可能是潲水油的一个依据。
[0011]用本发明设计的LAMP引物与引物是同一个概念。
[0012]用本发明所述的DNA核苷酸序列与所述的DNA序列是同一个概念。
[0013]
本发明的引物设计思路是:选用5种畜禽DNA中都具有的、相同的DNA作为动物源DNA，该动物源DNA可代表所选用的5种畜禽DNA中的某一种，并还能代表这5种畜禽DNA的任意组合。该5种畜禽是牛、猪、羊、鸡和兔。
[0014]本发明的LAMP技术也是LAMP法的含义，也就是环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplificat1n,)简称 LAMP 技术或 LAMP 法。
[0015]本发明的引物设计技术概述:选用5种畜禽DNA中都具有的、并且对于这5种畜禽是高度保守的16S rRNA DNA序列中的片段作为靶基因序列，即在5种畜禽的16S rRNA DNA序列中选取了保守性最好、引物用于LAMP法检测操作误差小、引物对靶基因检测灵敏度高的16S rRNA DNA序列中的片段作为引物技术设计的靶基因序列。达到所设计的引物能代表5种畜禽中任何一个畜禽16S rRNA DNA存在，而16S rRNA DNA又能代表有5种畜禽肉的目的。
[0016]本发明的引物设计原理如下:
(I)选取16S rRNA DNA作为靶基因序列:因食用肉种和动物油脂来源大部分为畜禽，检测的DNA祀基因序列应在闻等动物中具有各种易于检测的特点。线粒体DNA是闻等动物唯一的核外遗传物质，所有组织细胞中均含有大量的线粒体，因此可以获得大量的线粒体DNA。本发明中，我们选择了 5种畜禽线粒体DNA中都具有的、并且在这5种畜禽DNA序列中高度保守的16S rRNA DNA序列作为靶基因序列。
[0017](2)靶基因序列的获取:按当前生物基因组数据的获取通用方法，即通过NCBI(Nat1nal Center for B1technology Informat1n,美国国立生物技术信息中心)管理的GENEBANK数据库进行查询，所获序列都是对全世界公开的，研究人员都可以无偿获取使用。在GENEBANK网络数据库选取了猪，牛，羊，鸡和兔5种畜禽的16S rRNA DNA序列中共有的序列片段，作为靶基因序列。即可以选用5种畜禽中任何一个动物的16S rRNA DNA序列中我们确定的靶基因序列作为本发明引物设计之用，并且用任何一个动物的靶基因序列为基础都可设计出本发明提供的引物。
[0018](3)选择引物的基础DNA核苷酸序列:由于16S rRNA DNA序列相当保守，我们选取猪，牛，羊，鸡和兔任何一种动物的16S rRNA DNA序列作为引物设计之用。具体设计引物时，我们选取16S rRNA DNA序列中保守性最高的、并且LAMP法检测效果最好的一段DNA作为设计引物的基础DNA，本发明的引物的基础DNA核苷酸序列如下:
Tgatccaaaattttgatcaacggaacaagttaccctagggataacagcgcaatcctgttctagagttcctatcgacaatagggtttacgacctcgatgttggatcaggacacccaaatggtgcaaccgctattaaaggttcgtttgttcaacgattaaagtcctacgtgatctgagttcagaccggagcaatccaggtcggtttctatctatttataatttctcccagtacgaaaggacaagagaaatgggo
[0019](4 )设计LAMP引物:用上述(3 )中引物的基础DNA核苷酸序列为依据，用现有引物设计技术，设计出本发明的LAMP引物即本发明的引物。
[0020]按LAMP反应原理，每次LAMP反应需4个单独引物同时反应，这4个单独引物作为一个引物组，即每组LAMP引物为4个单独引物，本发明的引物组中4个单独引物代号是:B3, F3, BIP, FIP0
[0021]设计引物时，B3, F3，BIP, FIP引物5’和3’最开始的一个碱基保证在5个物种中都是保守的；引物中5’ dG和3’ dG尽量小于-4.00。本发明的LAMP引物组中，4个单独引物核苷酸序列如下:
F3: CCTATTCAAGAGTCCATATCGAB3:TTCTCTTGTCCTTTCGTACT
FIP:GAACCTTTGATAGCGGTTGCAC-ATAGGGTTTACGACCTCGABIP:GTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGA-CAGATAGAAACCGACCTGG。
[0022]
用本发明的LAMP引物组检测植物油中是否含有动物源成分的检测方法如下:
步骤1、样品制备5种畜禽混合肉末:市场上购买新鲜的牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉和兔肉各100g，用天平称取猪肉20g，鸡肉20g，牛肉20g，羊肉20g和兔肉20g混合装入烧杯I中。将烧杯I中的肉全部倒入绞肉机中绞碎混匀，直至所有的肉绞成肉末状并混合均匀，将绞肉机中的所有肉末装入烧杯2中，烧杯2中的混合肉末即为5种畜禽混合肉末。
[0023]所述植物油是纯玉米油、纯花生油或纯菜籽油的某一种。
[0024]步骤2、提取对照组植物油中的DNA (作为空白对照样品之用):购买柱式植物油DNAout试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)；该柱式植物油DNAout试剂盒组成:溶液A，离心吸附柱，通用洗柱液(用于洗去非DNA物质)，通用洗脱液(用于获得DNA);提取DNA的步骤如下:
A.在1.5mL离心管I中加入0.2mL购买的植物油；
B.在1.5mL离心管I中加入0.6mL溶化状态的溶液A，植物油和溶液A在室温条件下混合振荡3-5min，获得植物油和溶液A的混合液；
C.将B步骤的全部混合液转移到离心吸附柱中，室温放置2min，使离心吸附柱充分吸附混合液；
D.把收集管套在离心吸附柱的下面；将已充分吸附混合液的离心吸附柱放入离心机，用离心机转速为12000g —15000g条件将其离心lmin，离心机停止后，植物油和溶液A的混合液被分离出穿透液，穿透液在收集管中，取下收集管，去掉收集管中的穿透液；
E.再把收集管套在离心吸附柱的下面；向离心吸附柱中加入0.SmL通用洗柱液，离心机转速为12000g-15000g室温离心lmin,去掉收集管中的穿透液；
F.再把收集管套在离心吸附柱的下面；离心机转速为12000g-15000g室温离心30秒，去掉收集管中的穿透液；
G.在离心吸附柱的滤膜中部加入30uL通用洗脱液，然后将离心吸附柱套在一个
1.5mL离心管2中，室温放置2min，使通用洗脱液充分溶解吸附柱中的DNA ；
H.把装有离心吸附柱的离心管2放入离心机，离心机转速为12000g-15000g室温离心lmin, 1.5mL离心管2中收集物为植物油的DNA样品。
[0025]
步骤3、制作含动物源成分的植物油样品