用天平称取Ig上述步骤I中所制备的5种畜禽混合肉末样品倒入家用平底锅中，用量筒量取10mL步骤2的植物油倒入家用平底锅中，把肉末样品和植物油混合均匀；将平底锅放在家用电磁炉上爆炒2min，爆炒温度为1000°C ;爆炒完后，将平底锅中炒制过的肉末去除，炒过肉末的植物油是含动物源成分的植物油样品。
[0026]
步骤4、提取步骤3所得样品的DNA，即提取含动物源成分植物油中的DNA购买柱式植物油DNAout试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)，柱式植物油DNAout试剂盒组成:溶液A，离心吸附柱，通用洗柱液(用于洗去非DNA物质)，通用洗脱液(用于获得DNA);提取DNA的步骤如下:
A.在1.5mL离心管3中加入0.2mL步骤3含动物源成分的植物油样品到广口瓶I中；
B.在1.5mL离心管3中加入0.6mL溶化状态的溶液A，将含动物源成分的植物油样品和溶液A在室温条件下混合振荡3-5min，获得含动物源成分的植物油和溶液A的混合液；
C.将B步骤的全部混合液转移到离心吸附柱中，室温放置2min，使离心吸附柱充分吸附混合液；
D.把收集管套在离心吸附柱的下面；将已充分吸附混合液的离心吸附柱放入离心机，用离心机转速为12000g -15000g条件将其离心lmin，离心机停止后，含动物源成分的植物油和溶液A的混合液被分离出穿透液，穿透液在收集管中，取下收集管，去掉收集管中的穿透液；
E.再把收集管套在离心吸附柱的下面；向离心吸附柱中加入0.SmL通用洗柱液，离心机转速为12000g-15000g室温离心lmin,去掉收集管中的穿透液；
F.再把收集管套在离心吸附柱的下面；离心机转速为12000g-15000g室温离心30秒，去掉收集管中的穿透液；
G.在离心吸附柱的滤膜中部加入30uL通用洗脱液，然后将离心吸附柱套在一个1.5mL离心管2中，室温放置2min，使通用洗脱液充分溶解吸附柱中的DNA ；
H.把装有离心吸附柱的离心管2放入离心机，离心机转速为12000g-15000g室温离心lmin, 1.5mL离心管2中收集物为含动物源成分植物油的DNA样品。
[0027]
步骤5、用LAMP法检测DNA
购买脱氧核糖核酸扩增试剂盒(Loompamp朗报荣研化学株式会社)，该脱氧核糖核酸扩增试剂盒组成为:
(1)2X反应缓冲液(RM)
(2)Bst DNA 聚合酶(Bst DNA Polymerase)
(3)去离子水(DW)
(4)引物溶液DNA (PM DNA)
(5)阳性对照DNA (PC DNA)ο
[0028]
LAMP法反应体系的试剂原料和配方如下:
2 X反应缓冲液(RM)12.5yL
引物:F30.5μ L B30.5 μ L
FIP0.5μ L
BIP0.5μ L
Bst DNA 聚合酶LOyL
去离子水(DW)6.5 μ L
模板 DNA3.0 μ L
试剂合计25.0 μ L。
[0029]
用LAMP法检测DNA的步骤如下:
A.处理含动物源成分植物油的DNA样品:在生物安全柜中冰上操作，向Loopamp?“朗报?”反应试管I中分别加入各原料:
加入12.5yL的2 X反应缓冲液(RM)，
加入6.5 μ L去尚子水(Dff),
加入0.5yL的F3，
加入0.5μ L的Β3，
加入0.5yL的FIP，
加入0.5yL的BIP，
加入1.0 μ L的Bst DNA聚合酶，
加入3.0 μ L步骤4获得的含动物源成分植物油的DNA样品1.5mL于离心管4中；合上Loopamp? “朗报?”反应试管I盖子，轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时注意不要产生气泡；
B.处理植物油的DNA样品:在生物安全柜中冰上操作，向Loopamp?“朗报?”反应试管2中分别加入各原料:
加入12.5μ的L 2 X反应缓冲液(RM)，
加入6.5 μ L的去离子水(Dff),
加入0.5yL的F3，
加入0.5yL的B3，
加入0.5yL的FIP，
加入0.5yL的BIP，
加入LOyL的Bst DNA聚合酶，
加入3.0yL的植物油的DNA样品在1.5mL离心管2中，该样品作为阴性对照；Loopamp? “朗报?”反应试管2盖子，轻击使溶液充分混合后瞬时离心。混合时请注意不要产生气泡；
C.将两个试样分别加热反应:将Loopamp?“朗报?”反应试管I和Loopamp? “朗报?”反应试管2分别放入63°C恒温水浴锅中水浴60min，然后将Loopamp? “朗报?”反应试管I和Loopamp? “朗报?”反应试管2放入95°C恒温水浴锅中水浴2min,使反应体系中的BstDNA聚合酶灭活以终止反应；
D.观察两个试样的反应结果:用肉眼观察Loopamp?“朗报? ”反应试管I和Loopamp? “朗报?”反应试管2中是否有白色浑池；结果为:Loopamp? “朗报?”反应试管I中有白色浑浊(为阳性)，Loopamp? “朗报?”反应试管2中无白色浑浊(为阴性)；反应试管I中是含动物源成分植物油的DNA样品，LAMP法检测有白色浑浊(为阳性);反应试管2中是植物油的DNA样品，LAMP法检测无白色浑浊(为阴性)。
[0030]
E.结论:按步骤3在10mL植物油中加入了 Ig的5种畜禽混合肉末爆炒的残余物，作为含动物源成分植物油的DNA样品，在本发明的引物组进行LAMP法检测，与对照组的植物油的区别可用肉眼观察出不同，说明本发明的引物组用LAMP法检测植物油中的动物源成分是可行的，灵敏度达到能检出10mL植物油中加入了 Ig的5种畜禽混合肉末爆炒2分钟后，残余在植物油中动物DNA。
[0031]
步骤6、荧光定量PCR检测植物油中动物源成分实验购买 Bestar SybrGreen qPCR mastermix (DBI B1science)
PCR反应体系:
Bestar SybrGreen qPCR mastermix 12.5 μ L 去尚子水8.5 μ L
引物:UN1-1-FIuL
UN1-1-RI μ L
DNA 模板2Μ1;
用步骤2的对照组植物油的DNA样品和步骤4的含动物源成分植物油的DNA样品分别进行荧光定量PCR检测，结果是均未有扩增反应，即荧光定量PCR检测不出步骤4的含动物源成分植物油的DNA样品中的动物源DNA，即本荧光定量PCR检测实验对动物源DNA的检测，达不到本发明的引物组用LAMP法检测动物源DNA的精度，说明本发明的引物组用LAMP法检测动物源DNA的精度优于荧光定量PCR。
[0032]
本发明的优点:本发明的引物组能检测出5种畜禽有牛、猪、羊、鸡和兔的DNA的存在，使检测潲水油中动物源的实验只需要用本发明的引物组在一次LAMP法检测DNA中完成，避免了检测潲水油中动物源的实验对牛、猪、羊、鸡和兔等动物源进行多次LAMP法检测DNA的问题。
[0033]按步骤3在10mL植物油中加入了 Ig的5种畜禽混合肉末爆炒的残余物，作为含动物源成分植物油的DNA样品，在本发明的引物组进行LAMP法检测，与对照组的植物油的区别可用肉眼观察出不同，说明本发明的引物组用LAMP法检测植物油中的动物源成分是可行的，灵敏度达到能检出10mL植物油中加入了 Ig的5种畜禽混合肉末爆炒2分钟后，残余在植物油中动物DNA。
[0034]用步骤2的对照组植物油的DNA样品和步骤4的含动物源成分植物油的DNA样品分别进行荧光定量PCR检测，结果是均未有扩增反应，即荧光定量PCR检测不出步骤4的含动物源成分植物油的DNA样品中的动物源DNA，即本荧光定量PCR检测实验对动物源DNA的检测，达不到本发明的引物组用LAMP法检测动物源DNA的精度，说明本发明的引物组用LAMP法检测动物源DNA的精度优于荧光定量PCR。
[0035]具体实施例
[0036]实施例1、本发明的检测植物油中动物源成分的LAMP引物组
我们选取猪，牛，羊，鸡和兔任何一种动物都具有的16S rRNA DNA序列作为引物设计之用。具体设计引物时，我们选取16S rRNA DNA序列中保守性最高的、LAMP法检测效果最好的一段DNA作为引物的基础DNA来设计LAMP引物，该引物的基础DNA序列如下:
Tgatccaaaattttgatcaacggaacaagttaccctagggataacagcgcaatcctgttctagagttcctatcgacaatagggtttacgacctcgatgttggatcaggacacccaaatggtgcaaccgctattaaaggttcgtttgttcaacgattaaagtcctacgtgatctgagttcagaccggagcaatccaggtcggtttctatctatttataatttctcccagtacgaaaggacaagagaaatgggo
[0037]用上面的基础DNA序列设计出本发明的4个单独引物构成的引物组，该4个单独引物为引物B3，引物F3，引物BIP，引物FIP;该4个单独引物的核苷酸序列如下:
F3: CCTATTCAAGAGTCCATATCGAB3:TTCTCTTGTCCTTTCGTACT
FIP:GAACCTTTGATA