中是否有白色浑池；结果为:Loopamp? “朗报?”反应试管I中有白色浑浊，Loopamp? “朗报?”反应试管2中无白色浑浊；反应试管I中是含动物源成分植物油的DNA样品，LAMP法检测有白色浑浊；反应试管2中是植物油的DNA样品，LAMP法检测无白色浑浊。
[0080] E.结论:按步骤3在10mL植物油中加入了 Ig的兔肉末爆炒的残余物，作为含动物源成分植物油的DNA样品，在本发明的引物组进行LAMP法检测，与对照组的植物油的区别可用肉眼观察出不同，说明本发明的引物组用LAMP法检测植物油中的动物源成分兔肉DNA是可行的，灵敏度达到能检出10mL植物油中加入了 Ig的兔肉末爆炒2分钟后，残余在植物油中动物DNA。
[0081 ] 所述植物油是纯玉米油、纯花生油或纯菜籽油的某一种，其中玉米油是建华牌四川省成都建华香油厂出品的标称纯玉米油；
花生油是惠宜牌山东玉皇粮油食品有限公司的标称纯花生油；
菜籽油是鲤鱼牌益海嘉里荣誉出品的称纯菜籽油。
【主权项】
1.植物油中动物源成分的LAMP法检测引物，该引物为4个单独引物构成的引物组，该4个单独引物为引物B3，引物F3，引物BIP，引物FIP;该4个单独引物的核苷酸序列如下:F3: CCTATTCAAGAGTCCATATCGAB3:TTCTCTTGTCCTTTCGTACTFIP:GAACCTTTGATAGCGGTTGCAC-ATAGGGTTTACGACCTCGABIP:GTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGA-CAGATAGAAACCGACCTGG。
2.用权利要求1所述植物油中动物源成分的LAMP法检测引物对植物油中动物源成分的LAMP法检测方法，其步骤如下: 步骤1、样品制备5种畜禽混合肉末:市场上购买新鲜的牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉和兔肉各100g，用天平称取猪肉20g，鸡肉20g，牛肉20g，羊肉20g和兔肉20g混合装入烧杯I中；将烧杯I中的肉全部倒入绞肉机中绞碎混匀，直至所有的肉绞成肉末状并混合均匀，将绞肉机中的所有肉末装入烧杯2中，烧杯2中的混合肉末即为5种畜禽混合肉末； 步骤2、提取对照组植物油中的DNA:购买柱式植物油DNAout试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)；该柱式植物油DNAout试剂盒组成:溶液A，离心吸附柱，通用洗柱液(用于洗去非DNA物质)，通用洗脱液(用于获得DNA);提取DNA的步骤如下: A.在1.5mL离心管I中加入0.2mL购买的植物油； B.在1.5mL离心管I中加入0.6mL溶化状态的溶液A，植物油和溶液A在室温条件下混合振荡3-5min，获得植物油和溶液A的混合液； C.将B步骤的全部混合液转移到离心吸附柱中，室温放置2min，使离心吸附柱充分吸附混合液； D.把收集管套在离心吸附柱的下面；将已充分吸附混合液的离心吸附柱放入离心机，用离心机转速为12000g —15000g条件将其离心lmin，离心机停止后，植物油和溶液A的混合液被分离出穿透液，穿透液在收集管中，取下收集管，去掉收集管中的穿透液； E.再把收集管套在离心吸附柱的下面；向离心吸附柱中加入0.SmL通用洗柱液，离心机转速为12000g-15000g室温离心lmin,去掉收集管中的穿透液； F.再把收集管套在离心吸附柱的下面；离心机转速为12000g-15000g室温离心30秒，去掉收集管中的穿透液； G.在离心吸附柱的滤膜中部加入30uL通用洗脱液，然后将离心吸附柱套在一个1.5mL离心管2中，室温放置2min，使通用洗脱液充分溶解吸附柱中的DNA ； H.把装有离心吸附柱的离心管2放入离心机，离心机转速为12000g-15000g室温离心lmin, 1.5mL离心管2中收集物为植物油的DNA样品； 步骤3、制作含动物源成分的植物油样品 用天平称取Ig上述步骤I中所制备的5种畜禽混合肉末样品倒入家用平底锅中，用量筒量取10mL步骤2的植物油倒入家用平底锅中，把肉末样品和植物油混合均匀；将平底锅放在家用电磁炉上爆炒2min，爆炒温度为1000°C ;爆炒完后，将平底锅中炒制过的肉末去除，炒过肉末的植物油是含动物源成分的植物油样品； 步骤4、提取步骤3所得样品的DNA，即提取含动物源成分植物油中的DNA 购买柱式植物油DNAout试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)，柱式植物油DNAout试剂盒组成:溶液A，离心吸附柱，通用洗柱液(用于洗去非DNA物质)，通用洗脱液(用于获得DNA);提取DNA的步骤如下: A.在1.5mL离心管3中加入0.2mL步骤3含动物源成分的植物油样品到广口瓶I中； B.在1.5mL离心管3中加入0.6mL溶化状态的溶液A，将含动物源成分的植物油样品和溶液A在室温条件下混合振荡3-5min，获得含动物源成分的植物油和溶液A的混合液； C.将B步骤的全部混合液转移到离心吸附柱中，室温放置2min，使离心吸附柱充分吸附混合液； D.把收集管套在离心吸附柱的下面；将已充分吸附混合液的离心吸附柱放入离心机，用离心机转速为12000g -15000g条件将其离心lmin，离心机停止后，含动物源成分的植物油和溶液A的混合液被分离出穿透液，穿透液在收集管中，取下收集管，去掉收集管中的穿透液； E.再把收集管套在离心吸附柱的下面；向离心吸附柱中加入0.SmL通用洗柱液，离心机转速为12000g-15000g室温离心lmin,去掉收集管中的穿透液； F.再把收集管套在离心吸附柱的下面；离心机转速为12000g-15000g室温离心30秒，去掉收集管中的穿透液； G.在离心吸附柱的滤膜中部加入30uL通用洗脱液，然后将离心吸附柱套在一个1.5mL离心管2中，室温放置2min，使通用洗脱液充分溶解吸附柱中的DNA ； H.把装有离心吸附柱的离心管2放入离心机，离心机转速为12000g-15000g室温离心lmin, 1.5mL离心管2中收集物为含动物源成分植物油的DNA样品； 步骤5、用LAMP法检测DNA 购买脱氧核糖核酸扩增试剂盒(Loompamp朗报荣研化学株式会社)，该脱氧核糖核酸扩增试剂盒组成为: (1)2 X反应缓冲液(RM) (2)Bst DNA 聚合酶(Bst DNA Polymerase) (3)去离子水(DW) (4)引物溶液DNA (PM DNA) (5)阳性对照DNA (PC DNA)； LAMP法反应体系的试剂原料和配方如下: 2 X反应缓冲液(RM)12.5yL 引物:F30.5μ L Β30.5 μ L FIP0.5μ L BIP0.5μ L Bst DNA 聚合酶LOyL 去离子水(DW)6.5 μ L 模板 DNA3.0 μ L 试剂合计25.0 μ L ； 用LAMP法检测DNA的步骤如下: A.处理含动物源成分植物油的DNA样品:在生物安全柜中冰上操作，向Loopamp?“朗报?”反应试管I中分别加入各原料: 加入12.5yL的2 X反应缓冲液(RM)， 加入6.5 μ L去尚子水(Dff), 加入0.5yL的F3， 加入0.5μ L的Β3， 加入0.5yL的FIP， 加入0.5yL的BIP， 加入1.0 μ L的Bst DNA聚合酶， 加入3.0 μ L步骤4获得的含动物源成分植物油的DNA样品1.5mL于离心管4中；合上Loopamp? “朗报?”反应试管I盖子，轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时注意不要产生气泡； B.处理植物油的DNA样品:在生物安全柜中冰上操作，向Loopamp?“朗报?”反应试管2中分别加入各原料: 加入12.5μ的L 2 X反应缓冲液(RM)， 加入6.5 μ L的去离子水(Dff), 加入0.5yL的F3， 加入0.5yL的B3， 加入0.5yL的FIP， 加入0.5yL的BIP， 加入LOyL的Bst DNA聚合酶， 加入3.0yL的植物油的DNA样品在1.5mL离心管2中，该样品作为阴性对照；Loopamp? “朗报?”反应试管2盖子，轻击使溶液充分混合后瞬时离心；混合时请注意不要产生气泡； C.将两个试样分别加热反应:将Loopamp?“朗报?”反应试管I和Loopamp? “朗报?”反应试管2分别放入63°C恒温水浴锅中水浴60min，然后将Loopamp? “朗报?”反应试管I和Loopamp? “朗报?”反应试管2放入95°C恒温水浴锅中水浴2min,使反应体系中的BstDNA聚合酶灭活以终止反应； D.观察两个试样的反应结果:用肉眼观察Loopamp?“朗报? ”反应试管I和Loopamp? “朗报?”反应试管2中是否有白色浑池；结果为:Loopamp? “朗报?”反应试管I中有白色浑浊，Loopamp? “朗报?”反应试管2中无白色浑浊；反应试管I中是含动物源成分植物油的DNA样品，LAMP法检测有白色浑浊；反应试管2中是植物油的DNA样品，LAMP法检测无白色浑浊； 所述植物油是纯玉米油、纯花生油或纯菜籽油的某一种。
【专利摘要】本发明植物油中动物源成分的LAMP法检测引物和检测方法涉及分子生物学中用LAMP法对动物DNA的检测。本发明提供了植物油中动物源成分的LAMP法检测引物组，该引物组包括4个单独引物B3，引物F3，引物BIP，引物FIP；和用该引物组对植物油中动物源DNA进行的检测的方法。本发明的优点：本发明的引物组能检测出5种畜禽有牛、猪、羊、鸡和兔的DNA，使检测潲水油中动物源成分的实验只需要用本发明的引物组在一次LAMP法检测DNA中完成；并且检测灵敏度达到能检出100mL植物油中加入了1g的5种畜禽混合肉末爆炒2分钟后，残余在植物油中动物DNA。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104611412
【申请号】CN201410539293
【发明人】谢锂纱, 谭志, 俞凌云
【申请人】四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年10月14日