下颠倒摇晃lOmin，然后在4°C，以12000r/min离心lOmin。
[0022] (3)离心后取上清液，放入新的1.5ml离心管中，再分别加入250 μ 1饱和酚和 250 μ 1氯仿，上下颠倒混勾lOmin，然后在4°C，以12000r/min离心lOmin。
[0023] (4)离心后取上清液加入新的I. 5ml离心管中，再加入500 μ 1氯仿，上下颠倒混匀 lOmin，在 4°C，以 12000r/min，离心 lOmin。
[0024] (5)吸取上清液放入新的I. 5ml离心管中，加入1/25上清液总体积的Nacl (5M)溶 液，再加入2倍上清液体积的无水乙醇（预先冷冻至-20°C )，静置沉淀。
[0025] (6)以12000r/min，离心IOmin后弃上清，在沉淀中加入70%乙醇50μ1，静置lh， 再以12000r/min离心5min，室温下自然风干后，加入超纯水溶解，4°C保存待用。
[0026] 三、重亚硫酸氢盐处理线粒体基因组DNA
[0027] 采用重亚硫酸氢盐处理试剂盒（产品编号E3318S，New Englang Biolabs Inc. USA)进行如下操作以获得重亚硫酸氢盐处理后的线粒体基因组DNA :
[0028] 取线粒体基因组10. O μ 1，在0. 2ml的PCR小管中与130 μ 1重亚硫酸盐混合物混 合，然后放入PCR仪中执行如下程序：95°C变性5min，65°C孵育30min ;再95°C变性5min， 65°C孵育60min ;再95°C变性5min，65°C孵育90min，最后18°C进行2h，取出后4°C保存待 用。
[0029] 将上述PCR小管中的液体转移到1.5ml离心管中，加入550 μ1 DNA Binding Buffer，轻轻混勾；再将混勾后的液体全部转移到2ml吸附柱中，15000g离心lmin，倒掉收 集管中的液体；再在吸附柱中加500 μ I Wash Buffer，15000g离心lmin，倒掉收集管中的 液体；再向吸附柱中加入 500 μ I Desulphonation Reaction Buffer，室温下（18°C-20°C) 孵育15min，在孵育期间盖上吸附柱的盖子，然后15000g离心lmin，倒掉收集管中的液体； 在吸附柱中重新加入500 μ I Wash Buffer，15000g离心lmin，倒掉收集管中的液体，重复该 步骤一次；然后，将吸附柱15000g离心lmin，去掉残留的Wash Buffer。
[0030] 将吸附柱重新放入一个新的I. 5ml离心管中，加入20 μ I Elution Buffer，孵育 Imin 后以 15000g 离心 Imin ;再加入 20 μ I Elution Buffer，孵育 Imin 后再以 15000g 离 心30s ;丢掉吸附柱，新I. 5ml离心管中的液体即为纯化后的重亚硫酸氢盐处理过的线粒体 基因组DNA。
[0031] 四、甲基化引物筛选
[0032] 利用在线软件 Methpr imer (www. urogene. org/methpr imer)设计三统梭子蟹 线粒体基因组甲基化位点检测引物，从众多引物中获得了如下一对扩增引物（引物名 称 SX-M-14902-15120):正向（5, -3'）：GATTTGGAGTATGGTTTGGTTTAGA，反向（5, -3'）： CAACACCTAATTTTAAAAAAAATAAAAACA
[0033] 五、甲基化位点标记检测PCR程序
[0034] 以重亚硫酸氢盐处理过的线粒体基因组DNA为模板，以SX-M-14902-15120为引 物，用New England Biolabs(USA)公司的热启动酶体系进行PCR扩增，具体反应体系为 25 μ 1，包含如下成份：
[0035] 热启动酶缓冲液5yl，10m Mol/L dNTP 0. 5μ1，正、反向引物各0. 5yl，DNA模板 5 μ 1，热启动酶（5U/μ 1)0. 125 μ 1，灭菌双蒸水 13. 375 μ 1。
[0036] 轻轻混匀上述反应体系后，在PCR仪中执行下列PCR程序：
[0037] 在95°C变性30s后执行如下循环35个：95°C变性15s，51°C 30s，68°C 30s。循环 结束后，再以68°C延伸5min，最后4°C保存。
[0038] 六、琼脂糖凝胶电泳检测
[0039] 利用2%琼脂糖凝胶对上述PCR扩增产物进行电泳分析，获得预期扩增条带后，进 一步回收并纯化该条带。
[0040] 七、测序分析
[0041] 把回收的条带（DNA片段）连接到质粒上，进一步转移进5 α大肠杆菌后送交DNA 测序公司进行测序，把测序结果与其原对应的三疣梭子蟹线粒体基因组DNA序列进行比 较，获得甲基化位点信息。
[0042] 八、数据分析
[0043] 由于不同母本在该位点上具有不同的甲基化状态，相应的这种甲基化状态也可以 遗传给子代个体，因此通过记录并比较不同母本在该甲基化位点的信息，可以把不同母本 所产生的子代个体区别出来。
【主权项】
1. 一种三疣梭子蟹线粒体基因组甲基化位点标记检测技术： 通过重亚硫酸氢盐处理三疣梭子蟹线粒体基因组DNA，再以该处理后的线粒体基因组 DNA为模板通过PCR方法进行甲基化引物的筛选，获得了一对适合于三疣梭子蟹线粒体基 因组中14902bp-15120bp区域甲基化特征分析的引物，其特征在于： 正向引物序列为 5' -GAITTGGAGTATGGITTGGITTAGA-3'，反向引物序列为 5' -CAACACCTA ATTTTAAAAAAAATAAAAACA-3'。
【专利摘要】本发明是一种三疣梭子蟹线粒体基因组甲基化位点标记检测技术，其特征是首先提取三疣梭子蟹线粒体基因组DNA，然后利用重亚硫酸氢盐对该线粒体基因组DNA进行处理，在此基础上利用设计的甲基化引物对该处理后的基因组DNA进行PCR扩增，并对获得的扩增产物进行测序分析，从中获得了一个含有甲基化位点的序列，进而确立了扩增该甲基化位点序列的PCR引物，利用该引物可以确定不同亲本及其子代的遗传特征。本发明适用于三疣梭子蟹种质鉴定、增殖放流标记等研究。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104611418
【申请号】CN201410820919
【发明人】高焕, 薛蓓, 赖晓芳, 阎斌伦, 陈建华, 董志国
【申请人】淮海工学院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年12月25日