基于signal-off的表面增强拉曼技术检测细胞内端粒酶活性的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于signal-off的表面增强拉曼技术检测细胞内端粒酶活性。
【背景技术】
[0002]癌症是目前危及人类健康的主要凶手之一，治疗癌症的最佳办法是早期发现、早期诊断、早期治疗。因此，开发新型、灵敏、特异性的早期诊断探针意义重大。
[0003]目前，癌症的临床诊断方法主要基于影像学检查组织和细胞形态，其分辨率较低，缺乏明确统一的标识分子等问题，难以实现癌症的早期诊断。如何寻找一种真正能够早期发现肿瘤并将其消灭于萌芽状态的方法，显得尤其迫切。现在临床上主要是依靠肿瘤标志物来进行癌症的早期发现和诊断的。其中，端粒酶被认为是一种很有前景的肿瘤标志物。
[0004]近年来，表面增强拉曼散射(surfaceenhanced Raman scattering, SERS)技术作为一种强有力的分析工具引起了人们的广泛关注，原因在于结构信息更丰富、光谱采集速度快、可避免多种物质间的相互干扰、信噪比高、灵敏度可达单分子水平、检测条件温和、对样品无接触、无损伤等。作为检测肿瘤标志物的一种重要分析方法，SERS检测技术将为肿瘤的早期诊断以及预后的监测起到更为重要的作用。但是，目前所采用的SERS检测方法大都基于signal-on的模式，对于signal-off模式的SERS检测肿瘤标志物的方法目前文献报道的较少。因此，制备基于signal-off的SERS检测探针，建立高灵敏、高特异性的SERS肿瘤标志物的检测方法，能够有效解决癌症早期诊断这一临床迫切需要解决的实际问题，具有很大的发展空间。
[0005]该专利制备的纳米探针为端粒酶响应的拉曼“开-关”结构，只有在端粒酶的作用下才会发生拉曼信号减弱或淬灭现象，实现细胞端粒酶活性检测。通过比较不同细胞内拉曼信号的强弱，可区分肿瘤细胞和正常细胞，利用药物作用后细胞内拉曼信号的变化，可实现细胞内端粒酶活性对药物响应的动态检测。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是:以石墨烯、氮化碳、MoS2, S12等为载体，在其上负载尺寸形貌可控的纳米金、纳米银或具有核壳结构的复合磁性纳米粒子，然后将包含端粒酶引物和拉曼分子信标的发夹探针固定在纳米粒子表面，建立基于signal-off的高灵敏、高选择性的SERS检测方法。当有靶存在时，在端粒酶的作用下引物延伸出具有重复序列的DNA链，与探针分子杂交，DNA发卡结构打开，其末端单链标记的拉曼信号分子远离拉曼基底，此时拉曼信号降低，实现端粒酶的高灵敏检测。以Hela宫颈癌细胞为模型，制备的探针实现了细胞内端粒酶活性的检测，以及端粒酶抑制药物作用后细胞内端粒酶活性变化的动态监测。通过对多种细胞进行成像，证实探针可用于区分肿瘤细胞和正常细胞。
[0007]本发明提出的可对细胞内端粒酶活性进行检测的纳米探针如图1所示。以石墨稀、氮化碳、MoS2> 3;102等为载体，在其上负载尺寸形貌可控的纳米金、纳米银或具有核壳结构的复合磁性纳米粒子，然后将包含端粒酶引物和拉曼分子的分子信标的发夹探针固定在纳米粒子上面。
[0008]本发明通过以下技术方案来实现:
I)基底包含两部分:一是载体，另一个是纳米粒子。纳米粒子可以通过表面原位生长或者浸渍等方法负载于载体表面。
[0009]2)探针通过巯基、氨基或者羧基等修饰固定在纳米金、纳米银、具有核壳结构的复合磁性纳米粒子的表面。
[0010]本发明的工作原理:
本发明的工作原理如图1所示，标记有罗丹明6G的纳米探针，在没有端粒酶存在时，由于发夹结构的存在，罗丹明6G靠近纳米粒子表面，拉曼信号被大大的增强。将探针与细胞共同孵育，探针进入细胞后，在端粒酶的作用下引物延伸出具有重复序列的DNA链，与探针分子杂交，DNA发卡结构打开，释放出末端单链，发夹结构被打开，其末端单链标记的拉曼信号分子远离拉曼基底，此时拉曼信号降低，实现端粒酶的高灵敏检测，区分肿瘤细胞和正常细胞。亦可利用所述的纳米探针对端粒酶抑制药物作用后的细胞进行端粒酶活性检测，分析药物对细胞内端粒酶活性的影响并对其进行动态监测。
【附图说明】
[0011]图1纳米探针对细胞内端粒酶原位成像检测的原理图。
[0012]图2肿瘤细胞和正常细胞拉曼对比图。
实施例
[0013]以下为实施本发明的具体示例，其作用在于进一步阐明本发明的内容，使阅读者更容易理解，但不构成对本发明要求的保护范围的限定或限制。
[0014]实施例一结合图1，合成可对细胞内端粒酶检测的纳米探针。
[0015]将20 μ L发夹DNA (150 μ M)和20 μ L端粒酶引物(150 μ Μ)与2mL载体负载的纳米粒子混合后，室温下搅拌20h。然后将0.2mL含有IM NaCl的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.8)逐滴加入到上述混合液中稳定纳米探针。将上述溶液离心并用PBS洗涤后，重新分散在ImLPBS中，得到纳米探针，于4°C条件下保存备用。
[0016]实施例二结合图2，利用纳米探针进行细胞内端粒酶活性的活性检测。
[0017]将HeLa细胞与探针共同孵育2h，利用激光共焦拉曼光谱仪进行观察。在端粒酶阳性的HeLa细胞中，发夹结构的探针被打开，拉曼信号减弱，可区分正常细胞和肿瘤细胞。将端粒酶抑制药物儿茶素与HeLa细胞共同孵育48h，然后加入20 μ L探针并温育2h，用拉曼光谱仪观察，可看到细胞内拉曼信号远高于肿瘤细胞的信号，说明细胞内端粒酶活性受到药物的抑制。
【主权项】
1.一种可对细胞内端粒酶活性进行检测的纳米探针，其特征为以石墨烯、氮化碳、皿052、3;102等为载体，在其上负载尺寸形貌可控的纳米金、纳米银、具有核壳结构的复合磁性纳米粒子；纳米粒子可以通过表面原位生长或者浸渍等方法负载于载体表面。
2.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于可特异性响应端粒酶，对细胞内端粒酶活性实现“开-关”可控的检测，可以区分肿瘤细胞和正常细胞，并动态监测细胞内端粒酶活性在端粒酶抑制药物作用下的变化。
3.根据权利要求1和2所述的纳米探针，其特征在于所用发夹探针，其上面3’端可修饰巯基、氨基或者羧基等(M)，5’端修饰罗丹明6G (R6G)，其发夹的环状部分可以识别端粒酶引物，在端粒酶的作用下引物延伸出具有重复序列的DNA链，与探针分子杂交，DNA发卡结构打开，释放出末端单链；所述的核苷酸序列为:探针序列:5’ -R6G-ACG TAG TCC GCTTTA AAC TCT GCT CG A CGG TAA AGC GGA CTA CGT - M -3’ ；端粒酶引物:5，- AAT CCGTCG AGC AGA GTT-3，。
4.根据权利要求1和2所述的纳米探针，其特征在于其荧光“开-关”的转换是通过发夹结构的闭合打开来实现的；当发夹结构为环状关闭结构时，罗丹明6G的拉曼信号被大大增强；当环被打开时，罗丹明6G远离纳米粒子表面，拉曼信号减弱。
5.根据权利要求1和2所述的纳米探针，其特征在于探针进入细胞后，在细胞质内端粒酶的作用下，引物延伸出具有重复序列的DNA链，与探针分子杂交，DNA发卡结构打开，释放出末端单链，发夹结构被打开，其末端单链标记的拉曼信号分子远离拉曼基底，此时拉曼信号降低，实现端粒酶的高灵敏检测，从而区分肿瘤细胞和正常细胞。
【专利摘要】本发明涉及一种基于signal-off的表面增强拉曼技术检测细胞内端粒酶活性。本发明以石墨烯、氮化碳、MoS2、SiO2等为载体，在其上负载尺寸形貌可控的纳米金、纳米银或具有核壳结构的复合磁性纳米粒子，然后将包含端粒酶引物和拉曼分子信标的发夹探针固定在纳米粒子表面，建立基于signal-off的高灵敏、高选择性的SERS检测方法。当有靶存在时，在端粒酶的作用下引物延伸出具有重复序列的DNA链，与探针分子杂交，DNA发卡结构打开，其末端单链标记的拉曼信号分子远离拉曼基底，此时拉曼信号降低，实现端粒酶的高灵敏检测。以Hela宫颈癌细胞为模型，制备的探针实现了细胞内端粒酶活性的检测，以及端粒酶抑制药物作用后细胞内端粒酶活性变化的动态监测。通过对多种细胞进行成像，证实探针可用于区分肿瘤细胞和正常细胞。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104611416
【申请号】CN201410744834
【发明人】孙召梅, 修宝, 郭英姝, 张书圣
【申请人】临沂大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年12月9日