Dna甲基化分析中dna样本重亚硫酸盐处理转化率的评估方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及合成DNA甲基化检测领域，主要是利用实时PCR评估重亚硫酸盐处理 DNA样本后胞嘧啶转化效率的方法。提供了DNA序列、引物序列及应用。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，与动植物许多生命过程如生长、发育和 分化相关，DNA甲基化异常也与人类许多疾病如肿瘤密切相关。研究和测定DNA甲基化已是 生命科学研究中重要内容。在DNA甲基化研究中，重亚硫酸盐处理DNA是一种最常见的检测 手段。重亚硫酸盐能将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，再使用后续检测手段检测修饰。重 亚硫酸盐处理DNA的转化效率决定了DNA甲基化检测的准确性，未完全转化的DNA会在随后 的检测中导致错误的假阳性结果。因此，评估重亚硫酸盐转化DNA的效率是非常必要的。本 研究提出一种简单可行的检测方法，通过Sybr Green评估重亚硫酸盐的DNA的转化效率。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是建立评估重亚硫酸盐处理DNA样本后胞嘧啶转化效率的有效方 法，快速、方便和准确地检测DNA样本经重亚硫酸盐转化的效率。
[0004] 本发明所述的方法能够有效的评估包括人源在内任何物种来源的DNA样品重亚硫 酸盐的转化率，为提高DNA甲基化分析准确性提供有效方法。
[0005] 在评估任何物种来源的DNA样品重亚硫酸盐的转化率中，合成与任何物种无同源 性的DNA与样本混合并作为参考序列，并针对该序列按照上述方法建立转化与未转的DNA标 准曲线，评估样本的转化效率。该方法具有更广泛的应用价值，并有效地降低检测成本。
[0006] 本发明方法，包括以下步骤：
[0007] (1)设计并合成下列DNA标准品及引物：
[0008] 1)标准品1:是指与任何已知物种无同源序列的DNA序列，该序列未经重亚硫酸盐， 也称为未转化的标准品；
[0009] 2)标准品2:是指标准品1中未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶后的序列；也称 为转化的标准品；
[0010] 3)引物1:是指根据标准品1的序列设计的用于扩增标准品1的检测引物；
[0011] 4)引物2:是指根据标准品2的序列设计的用于扩增标准品2的检测引物；
[0012] ⑵使用所述引物1和引物2,以所述标准品1与标准品2按照梯度稀释为模板，分别 做标准曲线，其中标准曲线以模板的拷贝数CN对应相应的Ct值；
[0013] ⑶将标准品1加入到待检测DNA样本中，
[0014] (4)将含有标准品1的待检测DNA样本使用重亚硫酸盐进行转化；
[0015] (5)使用引物1和引物2,以步骤(4)处理后的DNA样本为模板，分别检测样本中标准 品1与标准品2的Ct值;再根据步骤(2)中的标准曲线，计算出样本中标准品1与标准品2相应 的拷贝数；
[0016] (6)使用计算公式:重亚硫酸盐处理DNA转化率（％ )=标准品2的拷贝数/(标准品1 拷贝数+标准品2拷贝数）X 100%，计算转化率。
[0017] 本发明所述的方法适用于包括人源在内的任何物种基因组的重亚硫酸盐转化效 率的检测应用。所述的标准1和标准品2是人工合成与任何物种无同源性的DNA序列，作为一 个具体的实例，标准品1的序列如SEQ ID NO. 1所示，标准品2的序列如SEQ ID N0.2所示;但 并不限于此。标准1和标准品2的引物，本领域技术人员可以根据其具体序列进行设计并合 成。
[0018] 由于实时PCR的高度特异性和灵敏性，该方法可以检测极低的未转化完全的DNA样 本。为了评估方法的准确性，分别应用两种方法检测5组比例按不同混合的DNA模板，结果表 明该方法十分可靠。
[0019] 本发明分别以梯度稀释的重亚硫酸盐处理和未处理DNA标准品转化与未转化的 DNA的Ct值以及对应的DNA拷贝数的标准曲线。设计人工合成与任何物种无同源性的序列作 为样本的参考序列，使用SybrGreen法应用上述方法评估所有物种重亚硫酸盐处理样本的 转化效率，并对该检测方法进行可靠性评估，结果显示，该方法能够有效地评估DNA样品重 亚硫酸盐的转化效率，为广泛物种DNA甲基化准确分析提供了可靠快捷的方法。
【附图说明】
[0020] 图1.不同的引物分别检测待测样本中转化的和未转化的DNA模板，下划线标注的 碱基分别代表转化与未转化组碱基差异的位置。
[0021] 图2.精确测定重亚硫酸盐处理DNA转化效率的原理。基因组DNA分别经重亚硫酸盐 处理与未经重亚硫酸盐处理，两组模板分别使用不同的实时PCR引物进行相应的检测。 [0022] 图3.重亚硫酸盐处理与未经重亚硫酸盐处理所对应的人工合成参照序列的标准 曲线。重亚硫酸盐转化与未转化对应人工合成参照序列分别进行5倍梯度稀释作为模板，使 用SybrGreen实时PCR分别建立标准曲线。
[0023] 图4.比较焦磷酸测序法与实时PCR法对未完全转化样本的检测的准确性比较焦磷 酸测序未能有效监测重亚硫酸盐不良转化率的DNA样本A.使用过期的重亚硫酸盐试剂处理 的人源DNA样本。B.人源过量DNA样本，经过不适当的过期重亚硫酸盐试剂处理，未能有效检 出未转化的胞嘧啶。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0025] 1.1细胞
[0026] 人肾近曲小管上皮细胞(Human kidney-2，HK-2)和鼠源细胞Raw264.7来至本实验 室。
[0027] 1.2主要试验试剂
[0028] PowerSYfiR?Green PCR Master Mix试剂购于Invitrogen;DNeasy Blood and Tissue Kit购于Qiagen公司；EZ DNA Methylation-Gold Kit购于Zymo Research公司；实 时定量PCR引物以由上海桑尼生物科技公司合成。
[0029] 1.3引物
[0030] 人工合成的与任何已知物种无同源性的DNA及其引物（图1)。根据未转化的DNA序 列(标准品1)以及重亚硫酸盐转化后的DNA序列(标准品2)软件设计SybrGreen引物。引物如 下：
[0031] 引物1:
[0032] N-Uncon-2-5/22-F 5'-TGTCCTGTCAGGGTAGGGGTC-3'（SEQ ID N0.3)
[0033] N-Uncon-2-5/22-R 5'-GCTGTGTCAGCCTCTGTGTCC-3'（SEQ ID N0.4)
[0034] 引物2:
[0035] N-Con-2-5/22-F 5'-TTTTTGTTTTGTTAGGGTAGGGGT-3'（SEQ ID N0.5)
[0036] N-Con-2-5/22-R 5'-TCAACCTCTATATCCAAATATCAAATCT-3'（SEQ ID N0.6)
[0037] 1.4 DNA提取以及重亚硫酸盐转化
[0038] 按照DNeasy Blood and Tissue Kit说明书提取人肾近曲小管上皮细胞以及小鼠 鼠源细胞Raw264.7全基因组DNA。使用EZ DNA Methylation-Gold Kit，按照试剂盒说明书 用重亚硫酸盐处理DNA。
[0039] 1.5建立标准曲线和转化效率计算
[0040]任何物种DNA转化检测方法中，人工合成两段DNA序列用作定量PCR标准曲线的模 板。该序列分别对应经重亚硫酸盐转化与未经重亚硫酸盐转化的序列（图2)。
[0041] 按照如下公式计算:拷贝数/ng = 6.02 X 1023拷贝数/mol X载体摩尔质量(g/mol) X 1〇9。选取7个5倍梯度浓度DNA模板建立标准曲线。梯度浓度分别为3 X 107拷贝数、6 X 106 拷贝数、1.2 X 106拷贝数、2.4 X 105拷贝数、4.8 X 104拷贝数、9.6 X 103拷贝数和1.92 X 103拷 贝数。分别建立log拷贝数与Ct相对应的标准曲线（图3)。
[0042]待测样本使用引物1和引物2分别进行检测，得出Ct值，根据标准曲线计算出对应 DNA的拷贝数。使用如下公式计算单个样本的重亚硫酸盐的转化率。重亚硫酸盐处理DNA转 化率（％ )=转化的DNA拷贝数/(