专利名称：一种酿酒酵母菌株及其高效发酵甘蔗汁生产乙醇的方法
技术领域：
本发明属于酿酒酵母生物发酵领域，具体是乙醇发酵工业领域，特别是涉及一种优良酿 酒酵母菌株及其高效发酵甘蔗汁生产乙醇的方法。
背景技术：
以糖质原料生产燃料乙醇， 一直由于高昂的原料成本，而为人们所忽视。原油价格的不 断攀升，以及糖价的下跌，以及巴西甘蔗燃料乙醇的巨大成功，已经向世人展现出甘蔗乙醇 良好的市场潜力。我国南部，地处亚热带，气温高、阳光充足、多雨而秋旱，具有悠久的甘 蔗栽培历史并巳形成规模，不但具备了发展甘蔗燃料乙醇产业的自然条件，同时还形成了良 好的原料产业基础。遗憾的是，目前，在我国尚未见到规模化甘蔗汁发酵生产乙醇的产业应 用报道。尽管甘蔗乙醇还不是目前乙醇生产的主要形式，但作为一项储备技术，是有必要对
其进行研究的。
国内有一些研究甘蔗乙醇生产技术的相关文献报道，如
文献1:能源甘蔗生产燃料乙醇的发酵工艺优化作者潘琢郑穗平林影等作者 单位华南理工大学生物科学与工程学院刊名迎接工业生物技术的新世纪——第四届 发酵工程学术研讨会论文集，200文摘以能源甘蔗为原料，"新桥"酵母为发酵菌 种，在新鲜蔗汁中进行直接发酵，对氮源添加和发酵条件进行了研究。实验结果表明，氮源
的添加可以改善酵母的生长和发酵情况，发酵周期为66h，残糖为4.04g/l，酒精度为 11.5%，最适接种量为10%，最适发酵初始pH值为6.5，最适发酵温度为35'C，震荡状态下 的发醉可显著縮短发酵周期，发酵周期为32h。
文献2:适合甘蔗汁发酵高产酒精酵母的选育作者范元发江贤章陈由强等作 者单位福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心刊名生物技术，2008, (1)文 摘目的:选育出适合发酵甘蔗汁生产燃料乙醇的高产酿酒酵母的菌株。方法:以酵母菌株 YS5作为出发菌株,将酶解破壁后获得的原生质体进行紫外诱变，通过初筛和复筛进行选 育。结果:获得一株高产酒精的酿酒酵母突变株YS5-1，该突变株发酵甘蔗汁的乙醇含量可达 12.6n/。(V/V)，较出发菌株的11.6。/。(V/V)提高了 8.6%，其糖的转化率高达94.5%，高于出发菌 株的87.0%。结论:通过5次连续传代培养后其突变株的乙醇产量保持稳定，表明该突变株完 全可以用于发酵甘蔗汁生产燃料乙醇。
文献3:甘蔗生产燃料乙醇的发展现状及前景展望作者李苗苗于淑娟机 构华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510640刊名酿酒科技.2007(6).-111-113。
3文中提到，在国外，巴西的乙醇厂采用间接发酵和连续发酵两种工艺生产燃料乙醇，酵母被 分离出继续回用，成熟醪乙醇浓度可达8% 11%，发酵时间縮短至6 10h， 一天可回用3 次。新西兰的H.W.Doellel等以甘蔗汁为原料，以运动发酵单孢菌作为发酵菌株规模化生 产工业酒精，100L和1000L发酵试验显示，经17 20小时发酵后，其糖转化率为91 95 %，酒精浓度为10%(v/v)。 Limtong, S.等以甘蔗汁为原料，马克斯克鲁维酵母为发酵菌株生 产燃料酒精，该酵母耐40 45。C高温，在4(TC发酵，酒精浓度为6.78% (w/v)，酒精得率 为60.4%。
到目前为止，糖厂的酒精生产都以糖蜜为原料，虽然甘蔗汁与糖蜜一样以含蔗糖成分为 主，但甘蔗汁有其特殊性，如甘蔗汁灰分较少，而蛋白质、胶体等较多，易引起发酵过程中 影响酵母繁殖、酵母菌絮凝、发酵速度偏慢和生产工艺繁琐易等问题。针对甘蔗汁直接发酵 的特殊性，选育出适宜蔗汁发酵的酵母菌种，改进并优化其发酵工艺，以期提高产率方面需 开展深入研究。国内外的研究人员已经对甘蔗乙醇的生产做了大量的有价值的研究工作，其 中，巴西尤为突出，取得了显著的成效，其采用天然优良酵母发酵，并结合酵母回用技术。 但针对我国目前乙醇厂的现状，进行酵母回用技术，不但设备需要改进，而且对工作人员的 要求相对较高，如何有效利用现有设备进行甘蔗乙醇的生产，本发明进行了有益的探索。
发明内容
本发明的目的是针对甘蔗汁直接发酵生产乙醇菌株发酵速度偏慢、残糖高、生产工艺繁 琐等不足，提供一种适宜蔗汁发酵的优良酿酒酵母菌株，并提供该菌株在蔗汁产乙醇中的单 浓度连续流加发酵工艺方法，以填补我国在该项生产技术领域的空白。
本发明所提供的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)，是发明人利用生物学手 段，从酒精厂排污口的土壤中分离选育得到的一株耐高温、耐酒精、适合甘蔗发酵的菌株， 即酵母菌株gXas02，已于2008年7月19日保藏在位于中国武汉市武汉大学的中国典型培 养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M208110。
CCTCC N0:M208110的分离选育过程如下
从酒精厂排污口采集废弃的醪液、废水、淤泥及周边的泥土作分离样品，分别接入含 50mlYPD (葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、自然pH值)液体的250ral三角瓶 中，接入的分离样品约为lg， 3(TC， 160rpm摇瓶富集培养24h。取富集培养液进行不同浓 度的稀释，涂YPD平板，3CTC培养2天，将菌株稀释涂布于TTC下层平板中，3(TC培养24h, 长出可见菌落后，选择菌落数为100 300的平板倒入约12mL TTC上层培养基覆盖原来菌 落，之后在3(TC下避光保温2 3h，由菌落的呈色来判定酵母产酒精能力的大小。通过TTC 显色剂对酵母代谢产物的呈色特性，筛选出产酒精能力强的酵母。发明人按照上述方法，先后从来自于2个酒精厂，共4批的30余份样品中，选择出一个属于本发明的，具有利用甘 蔗汁产酒精优良发酵特性的分离物，实验室编号gxas 02，即CCTCC N0:M208110。 CCTCC N0:M208110的分类鉴定
CCTCC N0:M208110的细胞形态特征为圆形或卵圆形，在幼年菌落中，细胞为4 14X 3 7微米，长和宽的比率是l: 1 1: 2，在麦芽汁中沉淀，子囊孢子圆形，平滑。
挑取含CCTCC N0:M208110平板上的单菌落，接种于含3mlYPD培养基的指形瓶中，30 'C， 160rpm，过夜培养，然后，利用酵母总DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提 取CCTCC NO，8110的基因组DNA。
其中采用
正向引物NL-1:5 ， -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ，， 反向引物NL-4:5' -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，，
以CCTCC N0:M208110的总DNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR),扩增大小为 575bp的26S rDNA Dl/D2区域核苷酸序列，扩增产物连接到pMD18—T载体(大连宝生物工 程有限公司)上，用此序列在Genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(Nucleitide — Nucleitide BLAST)。搜索结果表明CCTCC N0:M208110的26S rDNA Dl/D2区域核酸序 歹U ， 与 Genbank 现有 Saccharomyces cerevisiae isolate TJY-29 、 Saccharomyces cerevisiae isolate NY3-4 Saccharomyces cerevisiae isolate NY3-2禾口 Saccharomyces cerevisiae isolate NY3-1等同一区域核酸序列同源性均达到100%。
由于CCTCC N0:M208110单纯的26S rDNA Dl/D2区域核酸序列与其他菌株的没有区 别，为了更好的区别该菌株，对该菌株和酿酒酵母的测序菌株S288C进行了 CGH (comparative genomic hybridization)的生物芯片，并进行了荧光交换实验，寻找到 271个与S288C有明显差异的基因，23个基因拷贝数明显增多，主要集中在第17条染色体 上，248个基因拷贝数明显减少，分布在其余的16条染色体上。
将CCTCC N0:M208110进行温度和酒精耐受度测试，发现该菌株为能耐受高温、高糖和 高酒精菌株，其温度耐受度为37。C，耐糖度为60%质量比的葡萄糖，酒精耐受度体积百分比 为20%。
根据上述的菌落外观、细胞形态、生理生化与分子生物学特征的可以确定，CCTCC N0:M208110的分类地位属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
本发明还提供了利用CCTCC N0:M208110直接发酵蔗汁生产乙醇的单浓度流加发酵方 法。具体工艺方法如下
将CCTCC N0:M208110按微生物发酵常规液体种子培养方法，以YPD培养基，即葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、自然pH值进行培养，当每毫升培养液含酵母菌数达 到1.5亿个以上时，按1 10%的接种量转接到处理过的甘蔗汁中(添加了浓硫酸调整pH为 3.0 4.0并添加质量比为0.1%的尿素、质量比为0.02%的磷酸)，按此比例逐步放大，一 直到可以进行发酵罐培养，当发酵罐中发酵培养液满足流加条件时，即每毫升培养液含酵母 菌数达到1.5亿个以上，开始连续流加处理过的甘蔗汁进行发酵，按常规技术控制发酵罐培 养液酵母数及各发酵罐的常规运行参数， 一直到发酵醪成熟，然后便按常规的蒸馏工艺制取 乙醇。
采用本发明的单浓度流加发酵方法，发酵过程中，各罐温度控制在26 37°C，发酵所 用时间为12 16小时；其发酵生产乙醇全过程完成时，发酵液中乙醇体积百分比浓度为 8.6 9.4%，残糖为0.2 0.3g/100ml。本工艺可在一个发酵罐内进行也可以在多个发酵罐中 进行。
与现有技术相比，本发明具有的突出的实质性特点和显著的进步是
1、 分离选育出了适于蔗汁直接发酵的优良发酵菌株
本发明人通过大量筛选比较，分离选育出了具有多种优良特性的酿酒酵母菌株CCTCC N0:M208110。该菌株适合发酵的温度范围较广，耐高糖的能力较好，可以满足单浓度流加工 艺的要求，同时，还具有发酵速度快、糖利用率高等特性，适合甘蔗汁为原料的乙醇发酵。
2、 生产工艺得到了优化
通过选育并利用优良的发酵菌株，使得效率更高的单浓度流加工艺得以实现。该工艺相 较现有的双浓度流加工艺，工艺得到了大大简化，不但工艺更易于控制，同时还节省了发酵 罐的投入，增加了设备的使用效率，降低了生产成本，提高了生产效率，并可获得更高酒精 浓度的发酵醪，使酒精得率明显提高。而且，本工艺未采用巴西现行的酵母回用技术，工艺 流程和操作方法更加简化。
图1是CCTCC N0:M208110与酿酒酵母S288C比较的染色体差异图。 图2是单浓度流加发酵制备乙醇工艺流程图。 保藏信息说明
一种酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae gxas02，真空冷冻干燥保藏于中国典型 培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC N0:M208110，保藏日期为2008年7月19日。
具体实施例方式
下面结合附图2，通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但不限制本发明。实施例一20L三联发酵罐甘蔗汁发酵乙醇小试
1、 液体培养基小量酵母菌种培养
将在YPD平板保藏的CCTCC N0:M208110单菌落接入液体YPD培养基中，培养温度 28°C，过夜培养。
2、 液体培养基扩大酵母菌种培养
以步骤1中的YPD培养液为种子液，按1%的接种量接入处理过的甘蔗汁(添加浓硫酸 调整pH为3.5 4.0，添加质量比为0. 1%的尿素，质量比为0.02%的磷酸)，制备得到 500ml甘蔗汁培养液。
3、 20L三联发酵罐甘蔗汁发酵
以步骤2中的甘蔗汁培养液为种子液，接入含IOL处理过甘蔗汁的1号发酵罐(容积为 20L)中，进行发酵，在1号发酵罐中控制通气量为100L/h，发酵温度3(TC，当菌体数达到 1.5亿个时，开始缓慢流加处理过的甘蔗汁，控制流速，维持菌体数，当1号罐体中发酵液 体积达到16L时，将1号罐与2号罐的接口打开，发酵液开始进入2号罐，当2号罐体中发 酵液体积达到16L时，将2号罐与3号罐的接口打开，发酵液开始进入3号罐，2号、3号 罐发酵温度32°C，菌体数在2亿以上，总发酵时间为12h，发酵醪成熟，酒度达到8.6 (V/V)，残糖达到0.3g/100ml。
实施例二甘蔗汁发酵日产10吨乙醇中试
1、 液体培养基小量酵母菌种培养及液体培养基扩大酵母菌种培养同实施例一。
2、 以甘蔗汁为原料发酵，日产10吨乙醇中试。
参照附图2，将CCTCC N0:M208110菌株扩大培养到50L后，所得的新鲜种子液接入处 理过的含10吨甘蔗汁的发酵罐(容积为120立方米)中进行发酵。甘蔗汁处理方法为在 蔗汁中添加浓硫酸调整pH为3.0 4.0，添加质量比为0.1%的尿素，质量比为0.02%的磷 酸。在1号罐中控制通气量，发酵温度26°C，当菌体数达到1.5亿个时，开始缓慢向1号 罐泵入同样处理过的甘蔗汁，控制流速，维持菌体数不变，当1号罐体中发酵液液面达到和 2号罐的连通管时，将1号罐与2号罐的接口打开，发酵液由于势能的驱动，开始进入2号 罐，控制菌体数，当2号罐体中发酵液液面达到和3号罐的连通管时，将2号罐与3号罐的 接口打开，发酵液发酵液由于势能的驱动，开始进入3号罐，待发酵醪成熟后，便送入蒸馏 塔按现有技术进行蒸馏制取酒精，二氧化碳由发酵罐上方的管路统一排出。整个过程其余各 罐发酵温度28'C，菌体数在1.5亿个以上，总发酵时间为12 16h，发酵醪成熟，酒精浓度 达到8.6% (V/V)，残糖达至U 0.3g/100ml。
实施例三甘蔗汁发酵日产10吨乙醇中试1、 液体培养基小量酵母菌种培养及液体培养基扩大酵母菌种培养同实施例一。
2、 以甘蔗汁为原料发酵，日产10吨乙醇中试。
参照附图2，将CCTCC N0:M208110菌株扩大培养到50L后，所得的新鲜种子液接入处 理过的含10吨甘蔗汁的发酵罐(容积为120立方米)中进行发酵。甘蔗汁处理方法为在 蔗汁中添加浓硫酸调整pH为3. 0 4. 0，添加质量比为0. 1%的尿素，质量比为0. 02%的磷 酸。在1号罐中控制通气量，发酵温度29°C，当菌体数达到2亿个时，开始缓慢向1号罐 泵入同样处理过的甘蔗汁，控制流速，维持菌体数不变，当1号罐体中发酵液液面达到和2 号罐的连通管时，将1号罐与2号罐的接口打开，发酵液由于势能的驱动，开始进入2号 罐，控制菌体数，当2号罐体中发酵液液面达到和3号罐的连通管时，将2号罐与3号罐的 接口打开，发酵液发酵液由于势能的驱动，开始进入3号罐，待发酵醪成熟后，便送入蒸馏 塔按现有技术进行蒸馏制取酒精，二氧化碳由发酵罐上方的管路统一排出。整个过程其余各 罐发酵温度3rC，菌体数在2亿以上，总发酵时间为12 16h，发酵醪成熟，酒精浓度达到 9.4% (V/V)，残糖达到0.2g/100ml。
实施例四甘蔗汁发酵日产10吨乙醇中试
1、 液体培养基小量酵母菌种培养及液体培养基扩大酵母菌种培养同实施例一。
2、 以甘蔗汁为原料发酵，日产10吨乙醇中试。
参照附图2，将CCTCC N0:M208110菌株扩大培养到50L后，所得的新鲜种子液接入处 理过的含10吨甘蔗汁的发酵罐(容积为120立方米)中进行发酵。甘蔗汁处理方法为在 蔗汁中添加浓硫酸调整pH为3. 0 4. 0，添加质量比为0. 1%的尿素，质量比为0. 02%的磷 酸。在1号罐中控制通气量，发酵温度32'C，当菌体数达到2亿个时，开始缓慢向1号罐 泵入同样处理过的甘蔗汁，控制流速，维持菌体数不变，当1号罐体中发酵液液面达到和2 号罐的连通管时，将1号罐与2号罐的接口打开，发酵液由于势能的驱动，开始进入2号 罐，控制菌体数，当2号罐体中发酵液液面达到和3号罐的连通管时，将2号罐与3号罐的 接口打开，发酵液发酵液由于势能的驱动，开始进入3号罐，待发酵醪成熟后，便送入蒸馏 塔按现有技术进行蒸馏制取酒精，二氧化碳由发酵罐上方的管路统一排出。整个过程各罐发 酵温度34°C，菌体数在2亿以上，总发酵时间为12 16h，发酵醪成熟，酒精浓度达到 9.1% (V/V)，残糖达到0.25g/100ml。
实施例五甘蔗汁发酵日产10吨乙醇中试
1、 液体培养基小量酵母菌种培养及液体培养基扩大酵母菌种培养同实施例一。
2、 以甘蔗汁为原料发酵，日产10吨乙醇中试。
参照附图2，将CCTCC N0:M208110菌株扩大培养到50L后，所得的新鲜种子液接入处理过的含10吨甘蔗汁的发酵罐(容积为120立方米)中进行发酵。甘蔗汁处理方法为在 蔗汁中添加浓硫酸调整pH为3. 0 4. 0，添加质量比为0. 1%的尿素，质量比为0. 02%的磷 酸。在1号罐中控制通气量，发酵温度35'C，当菌体数达到2亿个时，开始缓慢向1号罐 泵入同样处理过的甘蔗汁，控制流速，维持菌体数不变，当1号罐体中发酵液液面达到和2 号罐的连通管时，将1号罐与2号罐的接口打开，发酵液由于势能的驱动，开始进入2号 罐，控制菌体数，当2号罐体中发酵液液面达到和3号罐的连通管时，将2号罐与3号罐的 接口打开，发酵液发酵液由于势能的驱动，开始进入3号罐，待发酵醪成熟后，便送入蒸馏 塔按现有技术进行蒸馏制取酒精，二氧化碳由发酵罐上方的管路统一排出。整个过程各罐发 酵温度37°C,菌体数在2亿以上，总发酵时间为12 16h,发酵醪成熟，酒精浓度达到 8.6% (V/V)，残糖达到0.3g/100ml。序列表
〈110〉广西科学院
〈120〉一种酿酒酵母菌株及其高效发酵甘蔗汁生产乙醇的方法 <■ 1 <210> 1 <211〉 575 〈212> DNA
〈213>酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) <400> 1
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权利要求
1、一种能高效发酵甘蔗汁生产乙醇的生产菌，分类命名为酿酒酵母菌Saccharomycescerevisiae，菌株号为gxas02，是从酒精厂的排污口中采集分离得到的，真空冷冻干燥保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM208110，保藏日期为2008年7月19日。
2、 如权利要求1所述的生产菌，其特征在于所述菌株的26S rDNA Dl/D2区域具有序列1 所示的核酸序列，与Genbank现有Saccharomyces cerevisiae同一区域核酸序列同源性均 达到100%。
3、 如权利要求1所述的生产菌，其特征在于所述菌株与Genbank上公布的酿酒酵母测序 菌株Saccharomyces cerevisiae S288C在DNA水平上进行比较，有271个基因存在显著性 差异，其中，23个基因拷贝数明显增多，主要集中在第17条.(线粒体)染色体上，248个 基因拷贝数明显减少，分布在其余的16条染色体上。
4、 如权利要求1所述的生产菌，其特征在于所述菌株为能耐受高温和高酒精菌株，其温 度耐受度为37。C，酒精耐受度体积百分比为20%，葡萄糖耐受度质量比为60%。
5、 利用权利要求1所述的生产菌发酵甘蔗汁生产乙醇的方法，其特征在于生产过程如下 将CCTCC N0:M208110按微生物发酵常规液体种子培养方法，即以YPD培养基，即葡萄糖 20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、自然pH值进行培养，当每毫升培养液含酵母菌数达 到1.5亿个以上时，按1 10%的接种量转接到添加了浓硫酸调整pH为3.0 4.0并添加质量 比0.1%的尿素、质量比0.02%的磷酸的甘蔗汁中，并按1 10%的接种比例逐步放大，一 直到可以进行发酵罐培养，当发酵罐中发酵培养液满足流加条件时，即每毫升培养液含酵母 菌数达到1.5亿个以上，开始连续流加处理过的甘蔗汁进行发酵，按常规技术控制发酵罐培 养液酵母数及各发酵罐的常规运行参数， 一直到发酵醪成熟，然后即可按照常规技术进行蒸 馏制取乙醇；发酵过程中，发酵温度控制在26 37。C,发酵时间为12 16小时。
全文摘要
本发明涉及了一株优良酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae gxas02，及利用其为生产菌株，采用甘蔗汁为原料，进行规模化生产乙醇的方法。该菌株真空冷冻干燥保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM208110，保藏日期为2008年7月19日，经鉴定系酿酒酵母，该菌株适合甘蔗汁发酵乙醇，速度快，残糖低，耐高温，耐酒精。生产工艺采取单浓度连续流加工艺，在未使用酵母回用和固定化酵母技术的条件下，将经过压榨的但未经浓缩或稀释的甘蔗汁直接进行发酵，在日产10吨乙醇的生产线上，连续运行，效果良好，发酵时间为12～16h，酒度达到8.6～9.4(V/V)，残糖为0.2～0.3g/100ml。本发明具有实施方便，设备利用率高，发酵醪乙醇浓度高，糖的利用率接近论理值等特点，降低了生产乙醇的成本。
文档编号C12R1/865GK101434911SQ20081007382
公开日2009年5月20日 申请日期2008年10月6日 优先权日2008年10月6日
发明者妮 关, 杨登峰, 米慧芝, 肖代俊, 琦 陆, 黄志民, 黄日波, 黎贞崇 申请人:广西科学院