专利名称：原核细胞非融合可溶性表达体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。确切地说它是一种原核细胞非融合可溶性表达体系
背景技术：
随着二十世纪70年代大肠杆菌基因表达分子机制的深入了解，外源目的基因在大肠杆菌中的高效表达成为可能，同时，大肠杆菌表达系统技术也是最早应用于基因工程药物生产。由于大肠杆菌遗传背景清楚，繁殖快，成本低，表达量高，易于操作等诸多优势，目前大多数外源目的基因以及基因工程药物生产都是由大肠杆菌表达系统技术来实现。基于克服大肠杆菌内毒素、缺少翻译后修饰、高表达时易折叠错误而形成包涵体等不足，人们已开发出了其它多种基因表达体系，但目前尚不能完全取代大肠杆菌表达体系。
在大肠杆菌中，许多外源蛋白的高水平表达最后都会导致包涵体形成，包涵体是致密的不溶性蛋白和RNA的聚集体，含有大部分的表达蛋白。关于包涵体的形成有许多理论，众说纷纭，但一般认为，许多蛋白质的天然构象，并不是自发地一步折叠形成的，而是在一些辅助蛋白协助下，经过许多中间态逐步形成的。现已知的参与新生肽链折叠的辅助蛋白有两类，一类是指那些催化蛋白质特定异构反应的酶，称为折叠酶，这些异构反应是某些蛋白质折叠的限速步骤。大肠杆菌中研究最多的折叠酶有催化二硫键形成的二硫键异构酶DsbA、DsbB、PDI等；催化脯氨酸异构反应的蛋白质脯氨酸顺反异构酶PPI等。最近又发现硫氧还蛋白还原酶TrxB的缺失突变，能增强胞内蛋白二硫键形成。另一类辅助蛋白能保持未折叠或部分折叠蛋白的短暂稳定性，防止分子内或分子间不合适的相互作用，但它并不参与任何共价反应，称为分子伴侣。大肠杆菌的分子伴侣主要有GroES、GroEL、DnaK、DnaJ等。
按照蛋白质折叠的理论，体内蛋白聚集以致包涵体的形成，起源于肽链折叠过程中，部分折叠的中间态之间的错误聚合，而不是形成于成熟的天然态或完全解链的蛋白。包涵体的形成与那些折叠中间态的溶解性和稳定性有关。除了分子伴侣和折叠酶等，影响包涵体形成的因素还有蛋白质自身的性质，生长条件(宿主、培养温度、培养基组成、pH等)。
蛋白质沉淀形成包涵体有利的一面是可以利用包涵体的不溶性和致密性，通过超声波破碎，离心就能相对容易的对其进行初级纯化。此外，以可溶性蛋白形式表达往往易被蛋白酶降解，以包涵体形式表达却可以很稳定。纯化时可用盐酸胍或脲变性溶解包涵体中的蛋白质。透析除去变性剂后，蛋白质可重新折叠复性，然而这种方法亦有其弊端，经变性/复性后正确折叠的蛋白质的产量不稳定，有时会很低，尤其是表达产物富含二硫键时更显突出。
防止包涵体形成，最现实的办法是改善发酵条件，从培养和诱导条件入手。如降低大肠杆菌的生长温度，以减少肽链间疏水表面相互作用，增加折叠成可溶性空间结构的机会。改变pH值、缩短诱导时间、降低诱导物浓度等，但这类方法多是以牺牲表达量为代价。
鉴于大肠杆菌胞内折叠组装能力非常有限，也可采用分泌途径表达重组蛋白，包括转运(蛋白质通过细菌的内膜定位于周质空间)、分泌(穿过外膜到达胞外)。外源蛋白在细菌周质中的定位表达需要在N端融合一段细菌蛋白的疏水性信号肽，融合蛋白跨内膜后，细菌的信号肽酶将信号肽切除，因而可获得具有天然一级结构的产物。同时，氧化性的周质间隙可以模拟真核细胞的内质网环境，便于新生肽链折叠成天然结构。此外，周质间隙中蛋白水解酶较少，可使产物不易被降解，而提高表达蛋白的稳定性。胞外分泌避免许多问题如包涵体的形成，同时可使纯化较为简单。但这一系统的缺点是表达低，此外，信号序列虽不干扰融合蛋白的生物活性，但去除较困难或去除不彻底。
通过替换个别氨基酸，来寻找可生成天然蛋白的突变体，这种方法对一些蛋白的表达是行之有效的。但在实践中则存在两个问题一是难以预测哪种氨基酸的替代利于天然蛋白的生成；更重要的是由此产生的突变基因产物，溶解性虽有提高，但是对于蛋白质的功能、稳定性和药物学特性可能会有不良影响。
融合蛋白表达，是防止包涵体形成的另一胞内表达重要方式。虽然融合蛋白表达解决了外源基因表达的很多问题，但是，融合表达也有其缺点，如果融合蛋白的两部分互相作用很容易受蛋白酶的水解，融合蛋白部分与基因表达产物间的断裂及效率和成本，分离纯化去除融合蛋白时的成本等，也使得融合表达有其局限性。
近年来，为克服包涵体的形成，在表达外源基因的同时，共表达分子伴侣或折叠酶或相关功能蛋白，通常将这些辅助蛋白的基因克隆到相容质粒中。相当多的尝试获得了明显的成功。例如，共表达GroES和GroEL可显著提高D-核酸糖1，5-二磷酸加氧酶/酸化酶的折叠和组装效率，从而提高可溶性重组蛋白的产量；也能提高可溶性乙酰辅酶A脱氢酶的产量和组装效率，DnaK的共表达能减小人生长激素hGH包涵体并提高表达水平；也能提高可溶性胶原酶的产量。但这方面也有许多问题，其中最主要的是在一个宿主细胞中很难获得两个表达质粒，且其遗传稳定性也不理想。
发明内容
基于外源目的基因在原核细胞非融合表达的现状，尤其是表达产物富含二硫键的包涵体解决，利用大肠杆菌细胞进行基因工程药物生产时，包涵体变性/复性生物活性收率低，或为解决可溶性表达等所引起生产成本提高的现实问题。本发明的目的是提供一种原核细胞非融合可溶性表达体系，它是利用生物技术，构建一个转录单位，这个转录单位含有一种或二种具有独立翻译调控特征的辅助蛋白基因，通过表达的一种或二种辅助蛋白来促进该转录单位的外源目的基因表达产物实现非融合可溶性表达，而且上述的表达均在同一个原核宿主细胞。
本发明的目的可以通过以下措施和原则来达到1.设计一个原核细胞转录单位，这个转录单位的最上游是一个具有独立翻译调控特征的多克隆位点区域，这个区域用于重组(克隆)欲表达的各种外源目的基因，其目的是使外源目的基因能够得以高效表达。
2.转录单位的启动子与终止子是目前大多数原核细胞转录调控系统，如T7-lac(乳糖)双启动子和T7终止子，T7启动子和终止子，T3启动子和终止子，SP6启动子和终止子，乳糖启动子和终止子等等。
3.独立翻译调控的特征是通过原核细胞的rbs(核糖体结合位点)或称S-D序列以及AUG启始密码子调控外源目的基因的翻译或特定辅助蛋白基因的翻译。
4.在具有独立翻译调控特征的多克隆位点区域后面，是具有独立翻译调控特征的特定辅助蛋白基因区域。在此区域后面也可加上具有独立翻译调控特征的另一种特定辅助蛋白基因区域。通过一种或二种辅助蛋白来促进外源目的基因表达产物实现非融合可溶性表达。
5.所说的特定辅助蛋白是指硫氧还蛋白还原酶TrxA，二硫键异构酶DsbA、DsbB、PDI，脯氨酸顺反异构酶PPI，分子伴侣GroES、GroEL、DnaK、DnaJ等蛋白，以及有关能促进翻译的蛋白正确折叠而使其处于可溶的一类蛋白等。
6.上述原核细胞转录单位的构成顺序是转录启动子-rbs-AUG翻译启始密码子-多克隆位点-rbs-AUG翻译启始密码子-特定辅助蛋白基因-翻译终止密码子-转录终止子(简称转录单位I)。或是转录启动子-rbs-AUG翻译启始密码子-多克隆位点-rbs-翻译AUG启始密码子-特定辅助蛋白基因I-翻译终止密码子-rbs-翻译AUG启始密码子-特定辅助蛋白基因II-翻译终止密码子-转录终止子(简称转录单位II)。
7.上述转录单位I或转录单位II重组至原核细胞的克隆质粒，该克隆质粒本身具备可遗传特征和抗生素抗性基因(如卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素等)，利用原核宿主细胞的复制酶系进行自身复制。含有重组的转录单位I或转录单位II的质粒即原核细胞表达质粒，就是本发明所述的‘原核细胞非融合可溶性表达体系’，利用原核宿主细胞的转录、翻译酶系以及转录调控系统(针对转录单位的)实现转录单位I或转录单位II中各基因的表达。
8.当欲表达的各种外源目的基因被重组在7.所述的原核细胞表达质粒，利用原核宿主细胞的复制、转录、翻译酶系，使外源目的基因、一种(转录单位I)或二种(转录单位II)辅助蛋白基因分别在同一个宿主细胞得以共表达。通过一种或二种辅助蛋白促进外源目的基因表达产物实现非融合可溶性表达。
9.基因在原核细胞中的表达必须具备下列的条件需用原核的启动子和核糖体结合位点。此外，需要原核细胞核糖体结合位点(rbs)，rbs与起始密码子之间的距离对高效表达是十分重要的，rbs与AUG距离为3～11bp较为合适。
本发明的优点是本发明是将一种特定辅助蛋白基因或二种特定辅助蛋白基因与预表达的外源目的基因共建在一个转录单位中，在同一个原核表达宿主细胞，通过特定辅助蛋白基因与预表达的外源目的基因各自独立翻译调控系统进行胞内共同表达，利用特定辅助蛋白实现外源目的基因的非融合可溶性表达，尤其是含有较多二硫键的肽链得以非融合可溶性表达。如80个左右氨基酸残基组成的含四对二硫键的肽链，通过本原核细胞非融合可溶性表达体系，在原核细胞的一般生理条件下，使其在大肠杆菌细胞内的表达量占菌体总蛋白的10％以上，90％以上的表达产物为可溶性。
图1是转录单位I特征概括图。
图2是为重组了外源目的基因的转录单位I特征概括图。
图3是转录单位II特征概括图。
图4是为重组了外源目的基因的转录单位II特征概括图。
具体实施例方式实施例1.
按上述本发明目的的措施和原则，原核细胞非融合表达质粒pSYPU-1，是由T7-lac(乳糖)双启动子和T7终止子调控的转录单位。转录单位的各基因均由原核细胞SD序列、翻译启始密码子和翻译终止密码子分别调控各基因的翻译。转录单位的最上游是一个具有独立翻译调控的多克隆位点区域，该区域是用于重组(克隆)预表达的各种外源目的基因，其目的是使外源目的基因能够得以高效表达。紧随着该区域后面是一个具有独立翻译调控的硫氧还蛋白还原酶TrxA基因。构建的措施和原则按上述转录单位I的模式来实施。转录单位重组(克隆)至原核细胞的克隆质粒中，利用该原核细胞克隆质粒的复制调控区及原核宿主细胞的复制酶系进行自身复制，利用该原核细胞克隆质粒的卡那霉素抗性基因及其调控区进行克隆筛选。
表达的外源目的基因是抗神经兴奋肽II(anti-neuroexcitation peptideII，ANEP II)，ANEP II由72个氨基酸残基组成，分子量8268Da，含八个半胱氨酸残基，形成四对二硫键。将ANEP II基因重组在原核细胞非融合表达质粒pSYPU-1的多克隆位点区域，在ANEP II基因前加上AUG启始密码子，ANEP II基因的末端加翻译终止密码子。获得的重组pSYPU-1-ANEP II表达质粒转化至原核细胞-大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明ANEP II表达产物占菌体总蛋白的15％以上，ANEP II主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的90％以上。
实施例2.
按上述本发明目的的措施和原则，原核细胞非融合表达质粒pSYPU-1a的构建与pSYPU-1的原理及形式一样，不同之处是抗生素抗性基因是氨苄青霉素。
表达的外源目的基因是止痛抗肿瘤肽I(analgesic-antitumoral peptideI，AGAP I)，AGAP I由74个氨基酸残基组成，分子量7820Da，含八个半胱氨酸残基，形成四对二硫键。将AGAP I基因重组在原核细胞非融合表达质粒pSYPU-1a的多克隆位点区域，在AGAP I基因前加上AUG启始密码子，AGAP I表达的末端加翻译终止密码子。获得的重组pSYPU-1a-AGAP I表达质粒转化至原核细胞表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明AGAP I表达产物占菌体总蛋白的15％以上，AGAP I主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的90％以上。
实施例3.
按上述本发明目的的措施和原则，原核细胞非融合表达质粒pSYPU-1b的构建与pSYPU-1的原理及形式一样，不同之处是抗生素抗性基因是氯霉素。
重组pSYPU-1b-ANEP II表达质粒转化至大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明ANEP II表达产物占菌体总蛋白的12％以上，ANEP II主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的90％以上。
实施例4.
按上述本发明目的的措施和原则，原核细胞非融合表达质粒pSYPU-1c的构建与pSYPU-1的原理及形式一样，不同之处是抗生素抗性基因是四环素。
重组pSYPU-1c-ANEP II表达质粒转化至大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明ANEP II表达产物占菌体总蛋白的11％以上，ANEP II主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的90％以上。
实施例5.
按上述本发明目的的措施和原则，原核细胞非融合表达质粒pSYPU-2，是由T7启动子和T7终止子调控的转录单位。转录单位的各基因均由原核细胞SD序列、翻译启始密码子和翻译终止密码子分别调控各基因的翻译。转录单位的最上游是一个具有独立翻译调控的多克隆位点区域，该区域是用于重组(克隆)预表达的各种外源目的基因，其目的是使外源目的基因能够得以高效表达。紧随着该区域后面是一个具有独立翻译调控的硫氧还蛋白还原酶TrxA基因。构建的措施和原则按上述转录单位I的模式来实施。转录单位重组(克隆)至原核细胞的克隆质粒中，利用该原核细胞克隆质粒的复制调控区及原核宿主细胞的复制酶系进行自身复制，利用该原核细胞克隆质粒的抗生素抗性基因(卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素抗性基因)及其调控区进行克隆筛选。构建的表达质粒分别相应的是pSYPU-2、pSYPU-2a、pSYPU-2b、pSYPU-2c。
AGAP I基因分别克隆于原核细胞非融合表达质粒pSYPU-2、pSYPU-2a、pSYPU-2b、pSYPU-2c，重组了AGATP I基因的上述表达质粒，分别转化至大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明AGAP I表达产物占菌体总蛋白的12％以上，AGAP I主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的90％以上。
实施例6.
按上述本发明目的的措施和原则，原核细胞非融合表达质粒pSYPU-11，是在实施例1.原核细胞非融合表达质粒pSYPU-1的基础上，由二种辅助蛋白促进外源目的基因表达产物实现非融合可溶性表达。
pSYPU-11由T7-lac双启动子和T7终止子调控的转录单位，转录单位的各基因均由原核细胞SD序列、翻译启始密码子和翻译终止密码子分别调控各基因的翻译。转录单位的最上游是一个具有独立翻译调控的多克隆位点区域，该区域是用于重组(克隆)预表达的各种外源目的基因，其目的是使外源目的基因能够得以高效表达。紧随着该区域后面是一个具有独立翻译调控的硫氧还蛋白还原酶TrxA基因。紧随着具有独立翻译调控的硫氧还蛋白还原酶TrxA基因的后面，是一个具有独立翻译调控的另一个特定辅助蛋白基因-分子伴侣GroEL。构建的措施和原则按上述转录单位II的模式来实施。转录单位重组(克隆)至原核细胞的克隆质粒中，利用该原核细胞克隆质粒的复制调控区及原核宿主细胞的复制酶系进行自身复制，利用该原核细胞克隆质粒的卡那霉素抗性基因及其调控区进行克隆筛选。
表达的外源目的基因是ANEP II。将ANEP II基因重组在原核细胞非融合表达质粒pSYPU-11的多克隆位点区域，在ANEP II基因前加上AUG启始密码子，ANEPII基因的末端加翻译终止密码子。获得的重组pSYPU-11-ANEP II表达质粒转化至大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明ANEPII表达产物占菌体总蛋白的12％以上，ANEP II主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的95％以上。
实施例7.
按上述本发明目的的措施和原则，将原核细胞非融合表达质粒pSYPU-11中的卡那霉素抗生素抗性基因卡那霉素，分别由氨苄青霉素、氯霉素、四环素抗性基因替代，则分别得到原核细胞非融合表达质粒pSYPU-11a、pSYPU-11b、pSYPU-11c。
AGATP I基因分别克隆于原核细胞非融合表达质粒pSYPU-11a、pSYPU-11b、pSYPU-11c，重组了AGATP I基因的上述表达质粒，分别转化至大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明AGATP I表达产物占菌体总蛋白的11％以上，AGATP I主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的95％以上。
实施例8.
按上述本发明目的的措施和原则，原核细胞非融合表达质粒pSYPU-12是由T7启动子和T7终止子调控的转录单位，该转录单位的的各基因组成与pSYPU-11系列一样。
将原核细胞非融合表达质粒pSYPU-12中的卡那霉素抗生素抗性基因卡那霉素，分别由氨苄青霉素、氯霉素、四环素抗性基因替代，则分别得到原核细胞非融合表达质粒pSYPU-12a、pSYPU-12b、pSYPU-12c。
AGAP I基因分别克隆于原核细胞非融合表达质粒pSYPU-12、pSYPU-12a、pSYPU-12b、pSYPU-12c，重组了AGATP I基因的上述表达质粒，分别转化至大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE 3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分严物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明AGATP I表达产物占菌体总蛋白的10％以上，AGAP I主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的95％以上。
实施例9.
按上述本发明目的的措施和原则，原核细胞非融合表达质粒pSYPU-21，是在实施例6.原核细胞非融合表达质粒pSYPU-11的基础上，由二种辅助蛋白促进外源目的基因表达产物实现非融合可溶性表达。
pSYPU-21由T7-1ac双启动子和T7终止子调控的转录单位，转录单位的各基因均由原核细胞SD序列、翻译启始密码子和翻译终止密码子分别调控各基因的翻译。转录单位的最上游是一个具有独立翻译调控的多克隆位点区域，该区域是用于重组(克隆)预表达的各种外源目的基因，其目的是使外源目的基因能够得以高效表达。紧随着该区域后面是一个具有独立翻译调控的硫氧还蛋白还原酶TrxA基因。紧随着具有独立翻译调控的硫氧还蛋白还原酶TrxA基因的后面，是一个具有独立翻译调控的另一个特定辅助蛋白基因-分子伴侣DnaK。构建的措施和原则按上述转录单位II的模式来实施。转录单位重组(克隆)至原核细胞的克隆质粒中，利用该原核细胞克隆质粒的复制调控区及原核宿主细胞的复制酶系进行自身复制，利用该原核细胞克隆质粒的卡那霉素抗性基因及其调控区进行克隆筛选。
表达的外源目的基因是ANEP II。将ANEP II基因重组在原核细胞非融合表达质粒pSYPU-21的多克隆位点区域，在ANEP II基因前加上AUG启始密码子，ANEPII表达的末端加翻译终止密码子。获得的重组pSYPU-11-ANEP II表达质粒转化至大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明ANEPII表达产物占菌体总蛋白的11％以上，ANEP II主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的95％以上。
实施例10.
按上述本发明目的的措施和原则，将原核细胞非融合表达质粒pSYPU-21中的卡那霉素抗生素抗性基因卡那霉素，分别由氨苄青霉素、氯霉素、四环素抗性基因替代，则分别得到原核细胞非融合表达质粒pSYPU-21a、pSYPU-21b、pSYPU-21c。
AGAP I基因分别克隆于原核细胞非融合表达质粒pSYPU-21a、pSYPU-21b、pSYPU-21c，重组了AGAP I基因的上述表达质粒，分别转化至大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明AGATP I表达产物占菌体总蛋白的11％以上，AGAP I主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的95％以上。
实施例11.
按上述本发明目的的措施和原则，原核细胞非融合表达质粒pSYPU-22是由T7启动子和T7终止子调控的转录单位，该转录单位的的各基因组成与pSYPU-21系列一样。
将原核细胞非融合表达质粒pSYPU-22中的卡那霉素抗生素抗性基因卡那霉素，分别由氨苄青霉素、氯霉素、四环素抗性基因替代，则分别得到原核细胞非融合表达质粒pSYPU-22a、pSYPU-22b、pSYPU-22c。
AGAP I基因分别克隆于原核细胞非融合表达质粒pSYPU-22、pSYPU-22a、pSYPU-22b、pSYPU-22c，重组了AGAP I基因的上述表达质粒，分别转化至大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(37℃培养诱导3小时)后收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。菌体裂解液及超声上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系统分析表明AGA0 I表达产物占菌体总蛋白的10％以上，AGAPI主要存在于超声裂菌上清液部分，占其总表达量的95％以上。
权利要求
1.原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于在一个原核细胞转录单位，转录单位的启动子与终止子是目前原核细胞转录调控系统，T7-乳糖双启动子和T7终止子；T7启动子和终止子；T3启动子和终止子；SP6启动子和终止子；乳糖启动子和终止子；这个转录单位的最上游是一个具有独立翻译调控特征的多克隆位点区域，这个多克隆位点区域用于重组欲表达的各种外源目的基因，其目的是使外源目的基因能够得以高效表达；独立翻译调控的特征是通过原核细胞的rbs，核糖体结合位点，或称S-D序列以及AUG启始密码子调控外源目的基因的翻译或特定辅助蛋白基因的翻译；在具有独立翻译调控特征的多克隆位点区域后面，是具有独立翻译调控特征的特定辅助蛋白基因区域，在此区域后面也可加上具有独立翻译调控特征的另一种特定辅助蛋白基因区域；上述原核细胞转录单位的构成顺序是，转录启动子-rbs-AUG翻译启始密码子-多克隆位点-rbs-AUG翻译启始密码子-特定辅助蛋白基因-翻译终止密码子-转录终止子，简称转录单位I，rbs与AUG距离为3～11bp；或是，转录启动子-rbs-AUG翻译启始密码子-多克隆位点-rbs-翻译AUG启始密码子-第一种特定辅助蛋白基因-翻译终止密码子-rbs-翻译AUG启始密码子-第二种特定辅助蛋白基因-翻译终止密码子-翻译终止密码子-转录终止子，简称转录单位II，rbs与AUG距离为3～11bp；特定辅助蛋白是指能促进外源目的基因表达产物实现非融合可溶性表达的一类蛋白，硫氧还蛋白还原酶TrxA，二硫键异构酶DsbA、DsbB、PDI，脯氨酸顺反异构酶PPI，分子伴侣GroES、GroEL、DnaK、DnaJ以及有关能促进翻译的蛋白正确折叠而使其处于可溶的一类蛋白相关蛋白；转录单位I或转录单位II重组至一般性原核细胞的克隆质粒，该质粒本身具备可遗传特征和抗生素抗性基因，卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素，利用原核宿主细胞的复制酶系进行自身复制，含有重组的转录单位I或转录单位II的质粒就是原核细胞非融合可溶性表达体系，利用原核宿主细胞的转录、翻译酶系以及转录调控系统针对转录单位的，实现转录单位I或转录单位II中各基因的表达。
2.根据权利要求1所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位I的转录调控系统是T7-乳糖双启动子和T7终止子，特定辅助蛋白基因是硫氧还蛋白还原酶TrxA基因，将此转录单位I克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，就是原核细胞非融合可溶性表达质粒pSYPU-1系列，一般性的原核细胞克隆质粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨苄青霉素或氯霉素或四环素，构建的表达质粒就是pSYPU-1或、pSYPU-1a或、pSYPU-1b或、pSYPU-1c。
3.根据权利要求1所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位I的转录调控系统是T7启动子和T7终止子，特定辅助蛋白基因是硫氧还蛋白还原酶TrxA基因，将此转录单位I克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，就是原核细胞非融合可溶性表达质粒pSYPU-1系列，一般性的原核细胞克隆质粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨苄青霉素或氯霉素或四环素，构建的表达质粒就是pSYPU-2或、pSYPU-2a或、pSYPU-2b或、pSYPU-2c。
4.根据权利要求1或2所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位I的转录调控系统是T3启动子和T3终止子，特定辅助蛋白基因是硫氧还蛋白还原酶TrxA基因，将此转录单位I克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，就是原核细胞非融合可溶性表达质粒pSYPU-3系列，一般性的原核细胞克隆质粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨苄青霉素或氯霉素或四环素，构建的表达质粒就是pSYPU-3、或pSYPU-3a、或pSYPU-3b、或pSYPU-3c。
5.根据权利要求1或2所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位I的转录调控系统是乳糖启动子和终止子，特定辅助蛋白基因是硫氧还蛋白还原酶TrxA基因，将此转录单位I克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，就是原核细胞非融合可溶性表达质粒pSYPU-4系列，一般性的原核细胞克隆质粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨苄青霉素或氯霉素或四环素，构建的表达质粒就是pSYPU-4、或pSYPU-4a、或pSYPU-4b、或pSYPU-4c。
6.根据权利要求1或2所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位I的转录调控系统是SP6启动子和终止子，特定辅助蛋白基因是硫氧还蛋白还原酶TrxA基因，将此转录单位I克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，就是原核细胞非融合可溶性表达质粒pSYPU-5系列，一般性的原核细胞克隆质粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨苄青霉素或氯霉素或四环素，构建的表达质粒就是pSYPU-5、或pSYPU-5a、或pSYPU-5b、或pSYPU-5c。
7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位I的转录调控系统是T7-乳糖双启动子和T7终止子或T7启动子和终止子或T3启动子和终止子或乳糖启动子和终止子或SP6启动子和终止子或原核细胞其他的启动子和终止子或上述启动子和终止子的自由组合，特定辅助蛋白基因是分子伴侣GroEL或二硫键异构酶DsbA或DsbB或PDI或脯氨酸顺反异构酶PPI或分子伴侣GroES或DnaK或DnaJ或有关能促进翻译的蛋白正确折叠而使其处于可溶的一类蛋白，将此转录单位I克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，一般性的原核细胞克隆质粒的抗生素抗性基因是卡那霉素、或氨苄青霉素、或氯霉素、或四环素抗性基因，构建的表达质粒就是相应系列的原核细胞非融合可溶性表达体系。
8.根据权利要求1或2所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位II的转录调控系统是T7-乳糖双启动子和T7终止子，第一种特定辅助蛋白基因是硫氧还蛋白还原酶TrxA基因，第二种特定辅助蛋白基因是分子伴侣GroEL，将此转录单位II克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，一般性的原核细胞克隆质粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素，构建的表达质粒就是pSYPU-11，一般性的原核细胞克隆质粒中的抗生素抗性基因是氨苄青霉素、或氯霉素、或四环素，构建的表达质粒就是pSYPU-11a或、pSYPU-11b或、pSYPU-11c。
9.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位II的转录调控系统是T7启动子和终止子或T3启动子和终止子或乳糖启动子和终止子或SP6启动子和终止子，第一种特定辅助蛋白基因是硫氧还蛋白还原酶TrxA基因，第二种特定辅助蛋白基因是分子伴侣GroEL，将此转录单位II克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，一般性的原核细胞克隆质粒的抗生素抗性基因是卡那霉素、或氨苄青霉素、或氯霉素、或四环素抗性基因，构建的表达质粒就是相应系列的原核细胞非融合可溶性表达体系。
10.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位II的转录调控系统是T7-乳糖双启动子和T7终止子，第一种特定辅助蛋白基因是硫氧还蛋白还原酶TrxA基因，第二种特定辅助蛋白基因是分子伴侣DnaK，将此转录单位II克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，一般性的原核细胞克隆质粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素，构建的表达质粒就是pSYPU-21，一般性的原核细胞克隆质粒中的抗生素抗性基因是氨苄青霉素、或氯霉素、或四环素，构建的表达质粒就是pSYPU-21a或、pSYPU-21b或、pSYPU-21c。
11.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或1 0所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位II的转录调控系统是T7启动子和终止子或T3启动子和终止子或乳糖启动子和终止子或SP6启动子和终止子，第一种特定辅助蛋白基因是硫氧还蛋白还原酶TrxA基因，第二种特定辅助蛋白基因是分子伴侣DnaK，将此转录单位II克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，一般性的原核细胞克隆质粒的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨苄青霉素或氯霉素或四环素抗性基因，构建的表达质粒就是相应系列的原核细胞非融合可溶性表达体系。
12.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11所述的原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于转录单位的转录调控系统是T7-乳糖双启动子和T7终止子或T7启动子和终止子或T3启动子和终止子或乳糖启动子和终止子或SP6启动子和终止子或原核细胞其他的启动子和终止子或上述启动子和终止子的自由组合，第一种和第二种特定辅助蛋白基因是硫氧还蛋白还原酶TrxA或二硫键异构酶DsbADsbB或PDI或脯氨酸顺反异构酶PPI或分子伴侣GroES或GroEL或DnaK或DnaJ或有关能促进翻译的蛋白正确折叠而使其处于可溶的一类蛋白，但所述的第一种和第二种特定辅助蛋白在一个转录单位中不能是一样的，将上述转录单位克隆至一般性的原核细胞克隆质粒中，一般性的原核细胞克隆质粒的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨苄青霉素或氯霉素或四环素抗性基因，构建的表达质粒就是相应系列的原核细胞非融合可溶性表达体系。
全文摘要
本发明是一种原核细胞非融合可溶性表达体系，它是将一种特定辅助蛋白基因或二种特定辅助蛋白基因与预表达的外源目的基因共建在一个转录单位中，在同一个原核表达宿主细胞，通过特定辅助蛋白基因与预表达的外源目的基因各自独立翻译调控系统进行胞内共同表达，利用特定辅助蛋白实现外源目的基因的非融合可溶性表达，尤其是含有较多二硫键的肽链得以非融合可溶性表达。如80个左右氨基酸残基组成的含四对二硫键的肽链，通过本原核细胞非融合可溶性表达体系，在原核细胞的一般生理条件下，使其在大肠杆菌细胞内的表达量占菌体总蛋白的10％以上，90％以上的表达产物为可溶性。
文档编号C12N15/74GK101016552SQ200710006608
公开日2007年8月15日 申请日期2007年1月18日 优先权日2006年3月16日
发明者张景海, 刘岩峰, 吴春福 申请人:沈阳药科大学