一种猴早期妊娠检测的孕酮胶体金免疫层析试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物免疫化学检测技术领域，具体涉及一种猴早期妊娠检测的孕酮胶 体金免疫层析试纸条。
【背景技术】
[0002] 猴是一个总称，灵长目中很多动物被我们称之为猴，其大脑发达，是非人灵长类中 最高等的类群，猴一般为单胎动物，极少数会达到两个或者三个。猕猴是猴类中最常见的一 种，其代谢特点，生理机能及免疫代谢方面与人类极为相似，其繁殖季节一般为9月份至次 年的4月份；金丝猴也属于季节性繁殖动物，有很明显的交配高峰，一般在9-12月份，生产 一般在3-5月份。猕猴、金丝猴等猴类均为国家重点保护的野生动物，野外救治和人工繁育 种群数量较大，对其开展保护和利用，意义重大。繁殖问题是猕猴、金丝猴等等野生动物迀 地保护成败的关键问题之一。在繁殖监测技术方面，如今用于猴类妊娠检测的方法一般为 子宫触摸、B超检测和试剂盒检测等，但是由于子宫触摸法和B超检测会对猴类造成较大的 应激，容易造成流产和死亡；利用试剂盒检测，成本较高，耗时较长，并不是检测猴繁殖状态 的最佳方法。
[0003] 胶体金技术是在70年代初期由Faulk和Taylor创造的，该法经济节约，快速简 便，无需任何仪器，对动物无毒害作用，目前已经广泛的用于人、牛、猪等的早期妊娠检测。 尿液中的性激素及性激素代谢物的含量很好的反映了血液中性激素的变化，利用尿液中性 激素及代谢产物的含量也能检测动物的生理状态。孕酮是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激 素，是维持妊娠所必需。在怀孕期间，胎盘会大量分泌孕酮，经代谢从尿中排出。研究表明， 金丝猴和猕猴在妊娠一个月时孕酮水平便大幅度增加，故而可以利用尿液中孕酮的含量变 化来检测猴的早期妊娠。而且本发明在实施以前，曾试验用人医的现有的早期妊娠检测试 纸对金丝猴和猕猴的早期妊娠进行检测，也曾试验过用现有的牛孕酮检测试纸条对金丝猴 和猕猴的尿液进行了检测，但是并不能检测出金丝猴和猕猴是否早期妊娠的生理状态。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于研制一种能快速且无害的检测猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫 层析试纸条，使工作人员能够快速准确地监测掌握猴的繁殖生理状态，加强对繁殖期猴的 管理，从而提高猴的繁殖率。
[0005] 本发明是基于制备得到一种能够检测孕酮的单克隆抗体（该单克隆抗体是由杂 交瘤细胞LX20150930分泌的，申请人将该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株LX20150930， 于2015年9月30日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号 为CCTCCC2015170,通过制备胶体金，标记纯化后的抗体，优化各项层析条件等完成了本发 明。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现：
[0007]-种检测猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫层析试纸条，包含PCV底板，吸收垫、硝 酸纤维素膜、吸水滤纸、金标垫和样品垫；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所 述吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在PCV底板上，本发明的特征在于：所述 的金标垫上含有孕酮单克隆抗体，硝酸纤维素膜的两端分别是孕酮单克隆抗体金标垫和吸 水滤纸，二者相互交叠组成，同时孕酮单克隆抗体金标垫又与样品垫交叠组成；
[0008] 能检测猴早期妊娠的单克隆抗体是由保藏编号为CCTCCNO:C2015170的杂交瘤 细胞株LX20150930分泌的。
[0009] 本发明猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫层析试纸条研制过程包括孕酮试纸条最佳 条件的确定、试纸条的组装以及试纸条特异性、灵敏度、阳性率的鉴定。
[0010] 本发明所用的制备猴早期妊娠检测试纸条的检测方法属于竞争法，结果判定当试 纸条出现一条杠判定为妊娠，出现两条杠判定为未妊娠。
[0011] 本发明方法简便，易操作，经济且省时。
[0012] 进一步，检测猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫层析试纸条包括PCV底板、样品垫、孕 酮单克隆抗体金标垫，硝酸纤维素膜（NC膜）以及吸水滤纸，其中NC膜上设有一条检测线 (即T线）和一条质控线（即C线），在所述的NC膜的两端分别是孕酮单克隆抗体金标垫 和吸水滤纸相互交叠组成，同时孕酮单克隆抗体金标垫又与样品垫交叠组成。
[0013] 将胶体金颗粒标记到孕酮单克隆抗体上成为本发明的金标抗体，使其能够捕获猴 尿液中的孕酮激素；孕酮与0VA的偶联物包被与检测线（即T线）；羊抗小鼠IGg二抗包 被与对照线。将孕酮胶体金试纸条的样品垫一端放入猴尿液中，尿液样品将沿着试纸条移 动，当样品移动至孕酮单克隆抗体金标垫时，金标抗体会与样品中的孕酮优先结合成复合 物。如果样品中的孕酮有足够的量，那么当样品移动至检测线时，金标抗体将不会再与检测 线上的孕酮-0VA偶联物结合，故而金标抗体复合物不会在检测线上滞留，检测线不呈显红 色，只有一条对照线显色；若样品中无孕酮或者孕酮含量不足以使金标抗体完全结合，则金 标抗体便会与检测线上的孕酮-0VA偶联物结合使检测线成红色，试纸条便会有两条线显 色。
[0014] 本发明的的能检测孕酮的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株LX20150930所分泌的， 该杂交瘤细胞株LX20150930于2015年9月30日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培 养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO:C2015170。
[0015] 所述的孕酮包被原是购自上海药巢生物工程有限公司。
[0016] 本发明的杂交瘤细胞株LX20150930可在制备检测孕酮的单克隆抗体中应用。
[0017] 本发明的单克隆抗体可在制备检测猴早期妊娠的胶体金免疫层析试纸条中应用。
[0018] 本发明的胶体金免疫层析试纸条可在猴早期妊娠检测中的应用。
[0019] 申请人提供了一种检测猴早期妊娠的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括胶 体金试纸条对尿液进行检测的步骤。
[0020] 具体操作步骤如下：
[0021] 1、利用上海药巢生物工程有限公司提供的孕酮免疫原免疫小鼠，经过细胞融合后 获得保藏编号为CCTCCNO:C2015170的杂交瘤细胞株LX20150930 ;
[0022] 2、复苏保藏编号为CCTCCNO:C2015170的杂交瘤细胞株LX20150930免疫小鼠得 到腹水，并用辛酸硫酸铵法提纯的孕酮单克隆抗体；
[0023] 3、利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；同时优化标记条件；得到孕酮胶体金免疫 层析试纸条；
[0024] 4、对孕酮胶体金免疫层析试纸条的各项性能进行测定。
[0025] 本发明的突出效果建立了一种能够检测猴早期妊娠的胶体金免疫层析试纸条，并 对其进行的测定，结果表明该试纸条灵敏度高、特异性强，可直接检测尿液，对猴无伤害。而 早期尝试使用人的早期妊娠检测试纸及牛的孕酮检测试纸条对金丝猴和猕猴的尿液进行 了检测，并不能检测出其生理状态。
[0026] 更详细的技术方案如《【具体实施方式】》所述。
【附图说明】
[0027] 图1:本发明的孕酮胶体金免疫层析试纸条的结构及组装示意图。
[0028] 图2:胶体金最佳pH值确定。
[0029] 图3:本发明的孕酮胶体金免疫层析试纸条的成品及结果判定图。
[0030] 图4:本发明的猴孕酮胶体金免疫层析试纸条对金丝猴样本初步检测结果图。
[0031] 图5:本发明的孕酮胶体金免疫层析试纸条猕对猴重复样本初步检测结果图。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1单克隆抗体的制备与纯化
[0033] 1.杂交瘤细胞的制备：取免疫效果较好的小鼠的脾细胞进行细胞融合，融合前三 天对小鼠进行加强免疫，用骨髓瘤细胞与脾细胞混合，经PEG-2000处理后置37°C、5%C02 恒温培养箱中培养。之后根据细胞的生长情况，取细胞培养上清，利用ELISA方法筛选出分 泌孕酮抗体的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀