[0076] 2.硝酸纤维素膜（NC膜）的制备
[0077] 硝酸纤维素膜（NC膜）选用美国Millipore公司产品，规格25_X100m;安装膜， 调整机器，使膜在两铁板间松紧适度，膜眼应紧靠膜两边且松紧适度；确认要喷膜的检测 线、质控线，将抗体分放在左右两边，用XYZ3000喷金喷膜机喷膜，检测线即T线上喷1. 2ug/ uL的孕酮包被原，质控线即C线上喷0. 6ug/uL的羊抗鼠IGg;包被后的硝酸纤维素膜送入 真空干燥箱，40分钟后取出，封入内装干燥剂的铝箱带，室温存放备用。
[0078] 3.试纸条的制备
[0079] 本发明的孕酮胶体金检测试纸条包含PCV底板，吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水滤 纸、金标垫和样品垫；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；吸收垫、硝酸纤维素膜、金标 垫、样品垫依次粘贴在PCV底板上，金标垫上含有孕酮单克隆抗体，硝酸纤维素膜的两端分 别是孕酮单克隆抗体金标垫和吸水滤纸，二者相互交叠组成；同时孕酮单克隆抗体金标垫 又与样品垫交叠组成。
[0080] 4.结果判定
[0081] 结果如图3所示。图3中阴阳性判断标准如下：
[0082] 阴性（_) :T线显色，表示尿液中孕酮浓度低于试纸条的检测限。表示空怀（未受 孕）。
[0083] 阳性⑴：Τ线不显色，均表示猴尿液中孕酮高于试纸条的检测限。表示妊娠
[0084] 无效：未出现C线，说明胶体金免疫试纸条失效。
[0085] 实施例4孕酮胶体金试纸条的特异性、灵敏度和阳性率的测定
[0086]1.本发明的胶体金试纸条灵敏度的测定
[0087] 用甲醇将孕酮标准物稀释成不同的浓度梯度：3. 125ng/ml、6. 25ng/ml、12. 5ng/ ml、25ng/ml、50ng/ml。然后用本发明制备的试纸条进行检测，用TBS作为阴性对照，五分钟 后观察结果。
[0088]2.本发明的胶体金试纸条特异性检测
[0089]分别将雌酮、孕酮、睾酮、雌二醇、11a-羟基孕酮稀释成一定的浓度（25ng/mL)，用 本发明制备的试纸条进行检测，五分钟后观察结果。
[0090] 3.本发明的胶体金试纸条阳性率的检测
[0091] 取100ul的金丝猴和猕猴尿液滴加到已组装好的胶体金试纸条上，五分钟后观察 显色结果。
[0092] 结果分析
[0093] 1、氯金酸溶液的质量鉴定结果
[0094] 本发明中氯金酸溶液的鉴定方法是直接进行肉眼观察：溶液呈酒红色、无浑浊出 现、无肉眼可见的颗粒物悬浮物、清亮透明、无凝聚现象形成，说明制备出的胶体金溶液良 好，符合试验要求。
[0095]2、胶体金制备过程中各最佳条件的确定结果
[0096] (1)最适抗体量的确定
[0097] 结果显示，八个小试管1号管为对照，呈蓝色，而后2-8号管依次为浅蓝色、浅蓝 色、浅红色、浅红色、浅红色、红色、红色。可以清晰的得出抗体量为3-7ug/ml的小试管（即 编号为2-6号管）颜色均发生了改变，而8、9ug/ml(即编号为7-8号管）的小试管颜色为 红色，且两者颜色接近几乎无变化，说明所得结果抗体量为7ug/ml，因此本发明确定最适标 记抗体量为8ug/ml。
[0098] ⑵最适pH的确定
[0099] 从图2可以看出，该曲线的峰值在pH=13处，即在520nm处，pH为13的溶液吸 光值最大，得出最适pH值为13。
[0100] ⑶最适包被液的确定
[0101] 结果显示，由包被液b制成的试纸条显色较明显，而其他包被液所制试纸条显色 不明显或者不显色，故而得出，本发明的最适包被液为b号管即0.0 lmol/L的TBS溶液，PH =9. 0〇
[0102] (4)最适包被抗原量的确定
[0103] 结果显示，在包被抗原的量为1. 2ng/ml时显色结果较好。
[0104] 3、孕酮胶体金试纸条的性能测定结果
[0105] (1)灵敏度测定结果
[0106] 结果显不，孕酮标准液的浓度分别为3. 125ng/ml、6. 25ng/ml、12. 5ng/ml、25ng/ ml、50ng/ml。其中3. 125ng/ml、6. 25ng/ml为两条杜，12. 5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml为1条 杜。说明该试纸条的灵敏度为12. 5ng/ml。
[0107] (2)孕酮胶体金试纸条特异性检测
[0108] 结果显示，检测样品分别为TBS、雌酮、孕酮、睾酮、雌二醇，孕酮为一条杠，TBS、雌 酮、睾酮、雌二醇均为两条杠，即该试纸条与TBS、孕酮、睾酮、雌二醇无交叉反应出现，试纸 条特异性良好。
[0109] (3)尿液样本测定
[0110] 本实验对来自神农架的5只金丝猴的尿液样本和2只猕猴的尿液样本进行了初步 测定，结果如下：
[0111] 表3金丝猴样本测定结果
[0112]
[0113] 注：圆圆、神女、乔乔、娇娇、花花均为金丝猴名字。"一"显色较明显，表示阴性，" + " 没有显色，表示阳性。
[0114] 表4猕猴样本的重复测定结果
[0115]
[0116] 注："一"显色较明显，表示阴性，" + "没有显色，表示阳性。由于采样基地猕猴样本 较难采集故而初步检测仅采集了两只猕猴尿液。但本实施例对其进行了多次重复测定。
[0117] 本发明在金丝猴妊娠期观察了各个金丝猴的生理状态，实际情况与本发明测定结 果基本相符，并对猕猴进行了B超检测，检测结果与本发明相一致，说明本发明的试纸条具 备良好的可行性。
【主权项】
1. 一种检测猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫层析试纸条，包含PCV底板，吸收垫、硝酸 纤维素膜、吸水滤纸、金标垫和样品垫；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述 吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在PCV底板上，其特征在于：所述的金标垫 上含有孕酮单克隆抗体，硝酸纤维素膜的两端分别是孕酮单克隆抗体金标垫和吸水滤纸， 二者相互交叠组成，同时孕酮单克隆抗体金标垫又与样品垫交叠组成； 能检测猴早期妊娠的单克隆抗体是由保藏编号为CCTCCNO:C2015170的杂交瘤细胞 株LX20150930分泌的。2. 保藏编号为CCTCCNO:C2015170的杂交瘤细胞株LX20150930在制备检测孕酮的单 克隆抗体中的应用。3. 保藏编号为CCTCCNO:C2015170的交瘤细胞株LX20150930分泌的单克隆抗体在制 备检测猴早期妊娠的胶体金免疫层析试纸条中的应用。4. 权利要求1所述的孕酮胶体金免疫层析试纸条在猴早期妊娠检测中的应用。
【专利摘要】本发明属于动物免疫生化检测技术领域，具体涉及一种检测猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫层析试纸条。该试纸条包括PCV底板,吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、金标垫和样品垫；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在PCV底板上；其特征在于：金标垫上含有孕酮单克隆抗体；硝酸纤维素膜的两端分别是孕酮单克隆抗体金标垫和吸水滤纸，二者相互交叠组成，同时孕酮单克隆抗体金标垫又与样品垫交叠组成；能检测猴早期妊娠的单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC？NO：C2015170的杂交瘤细胞株分泌的。本发明的试纸条灵敏度高，操作简便，对提高猕猴、金丝猴等猴类的繁殖监测具有重要意义。CCTCC NO：C201517020150930
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105424937
【申请号】CN201510641133
【发明人】李翔, 韩丽, 杨利国, 肖运才, 马振伐, 陈礼, 刘锡玲, 陈建国, 郭爱珍, 滑国华
【申请人】华中农业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年10月5日