一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的免疫层析条及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种免疫层析条，特别涉及一种简单、快速检测猪繁殖与呼吸综合征 病毒抗体的免疫层析条及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome virus，PRRSV)是最能危害猪养殖业病毒。猪感染PRRSV引起猪的呼吸衰竭，母猪流产、死 胎。国内外上市猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗有灭活和减毒疫苗。
[0003] 猪繁殖与呼吸综合征病毒分欧洲型和美洲型，两型病毒核苷酸同源性达60%， 属于动脉炎病毒科，是正链单股RNA病毒。PRRSV基因组含10个开放读码框架（open readingframes，ORFs)，ORFla和ORFlb编码非结构蛋白，包括复制酶，0RF2a、0RF3、0RF4、 0RF5分别编码膜相关的N糖基化结构蛋白GP2a、GP3、GP4、GP5, 0RF2b、0RF6分别编码非糖 基化膜蛋白E和M，0RF7编码核衣壳蛋白N。在感染细胞里，主要的结构蛋白GP5、M中通过 二硫键形成异源二聚体复合体是形成PRRSV颗粒的先决条件，单独Μ蛋白或GP5不能形成 病毒PRRSV粒子，其他小的囊膜蛋白也是传染性病毒颗粒形成的必须条件。GP5和Μ蛋白涉 及PRRSV病毒组装和出芽生殖、涉及中和抗体生成，涉及与细胞表面受体结合而感染。
[0004] 猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ基因编码的Μ蛋白在各基因型和遗传谱系之间高度保 守，和GP5蛋白形成异源二聚体形。猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白在猪繁殖与呼吸综合 征病毒2型基因型上高度保守，具有广谱抗原性。
[0005] 猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白由于其高度疏水，且在病毒和细胞中含量甚微， 所以抽提或制备难度大，尚无猪繁殖与呼吸综合征病毒全长Μ蛋白制备方法，为研究Μ蛋白 的结构、抗原性以及免疫学作用，本发明提出了全长猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白的制 备方法及由Μ蛋白制备的简单、快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的免疫层析条。
【发明内容】
[0006]目前有许多方法检测猪血清中PRRSV特异性抗体，包括间接免疫荧光抗体法 (IFA)、酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)，尽管这些方法准 确灵敏检测PRRSV抗体，但这些方法样品准备和处理操作步骤繁多，必须有高端精密设备 和仪器的实验室使用。
[0007] 针对以上问题，本发明提供了一种简单、快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体 的免疫层析条，所述层析条是由样品垫、胶体金结合的垫、硝酸纤维素膜、吸收垫在PVC板 上顺次相互搭接而成，其特征在于：所述胶体金结合的垫为喷涂有胶体金标记的猪繁殖与 呼吸综合征病毒Μ蛋白的玻璃纤维纸，所述硝酸纤维素膜上具有作为捕获抗原的猪繁殖与 呼吸综合征病毒Μ蛋白喷涂的检测线，以及兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白多克隆抗 体喷涂的控制线。
[0008] 在本发明中，优选的，胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白按照以下方 法制备得到：用〇.lmol/L的1(20)3溶液调节胶体金溶液的pH值为6. 5,按照40μg/ml比例 加入猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白，混合lOmin后，再加入5% (w/w)的牛血清白蛋白，使 其终浓度为1 % (w/v)，室温搅拌20min，在4°C2000g离心lOmin，弃去沉淀，4°C12000g离 心60min，移去上清，沉淀用0· 01MρΗ7· 2PBS缓冲液洗涤2次，用0· 01MρΗ7· 2PBS缓冲液稀 释备用。
[0009] 在本发明中，优选的，胶体金颗粒的平均直径为40. 06±0. 7nm，所述的猪繁殖与呼 吸综合征病毒Μ蛋白的标记浓度为40μg/ml。
[0010] 在本发明中，优选的，所述的胶体金结合的垫是将浓度为0D523nni= 2. 0的胶体金标 记的猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白以15μΙ/cm的速度喷涂到玻璃纤维纸上得到的，所述 的检测线是将浓度为0.8mg/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白以1.0μΙ/cm的速度喷 涂到硝酸纤维膜上得到的，所述的控制线是将浓度为l.〇mg/ml的兔抗猪繁殖与呼吸综合 征病毒Μ蛋白多克隆抗体以1. 0μΙ/cm的速度喷涂到硝酸纤维膜上得到的，检测线和控制 线相隔8mm〇
[0011] 在本发明中，优选的，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白为1型猪繁殖与呼吸 综合征病毒Μ蛋白或2型猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白。更优选的，所述的猪繁殖与呼 吸综合征病毒Μ蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 6所示。
[0012] 进一步的，本发明还提出了一种使用该免疫层析条检测血清的方法，包括以下步 骤：10μ1血清直接上样样品垫，1分钟后加入100μ1显影液在显影槽中，沿膜移动，在检测 线形成PRRSVΜ蛋白-特异抗体复合体使颜色变红。该法在15分钟内完成，当检测线和控 制线明显都为红色，结果阳性，当只有控制线为红色，结果阴性，当控制线显红色，检测线暗 红，结果中性不能确定，如控制线不显色，结果无效。结果中性不能确定的，如果弱阳染色可 判为阴性。条带干燥后检测的结果尽管稍微增加了阳性和背景染色的密度，但结果较稳定。
[0013] 本发明公开了一种简易的及时检测方法，用横向流免疫层析条快速检测猪繁殖与 呼吸道病毒的保守膜蛋白Μ抗体，并进行了评估。该法用大肠杆菌可溶性的表达猪繁殖与 呼吸综合征病毒全长Μ蛋白检测猪血清的PRRSV抗体，并对临床采集的样本、试验性感染仔 猪血清进行检测。用标准的商用抗体检测ELISA试剂盒（HerdChektPRRSELISA)和间接 免疫荧光法检测同一样本比较，该法可检测所有已知含PRRSV抗体的血清，检测试验性感 染猪的灵敏度为93. 2%，检测临床样本血清的灵敏度98. 7%，对不含PRRSV抗体临床样本 和试验性感染样本血清检测，检测的特异性分别为98. 5%和99. 2%。
[0014] 在本发明中，优选的，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白采用以下方法制备 得到：
[0015] 在本发明中，优选的，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白采用以下方法制备 得到：
[0016] (1)猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白cDNA序列的克隆
[0017] 以猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA为模板，RT-PCR法合成猪繁殖与呼吸综合 征病毒Μ蛋白cDNA基因，RT-PCR产物酶切后，与同样酶切的pGEM-T质粒连接，获得 pGEM-T-PRRSV-M质粒；
[0018] (2)合成带有组氨酸标签的猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白cDNA序列
[0019] 以pGEM-T-PRRSV-M质粒为模板，设计引物合成带有组氨酸标签的猪繁殖与呼吸 综合征病毒Μ蛋白cDNA序列，合成的带有组氨酸标签的猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白 cDNA序列酶切后，与同样酶切的表达质粒pMAL-p2X或pMAL-c2X连接；
[0020] (3)猪繁殖与呼吸综合征病毒MBP-M蛋白大肠杆菌中的表达
[0021] 连接产物转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序正确后，得到重组质粒pMAL_p2X MBP-M-6XHis;将含有重组质粒pMAL-p2XMBP-M-6XHis的大肠杆菌接种LB培养基，按 1:200~1:1000(V/V)转接到含有18LLB培养基的20L的发酵罐中，以250rpm转速37°C 培养4~6h，菌液0D600达到0. 5~0. 7时，按浓度0. 5~0. 7mmol/L加入IPTG诱导4~ 6h，4000rpm离心25min，获得湿重为110~120g/L的细菌培养物；
[0022] (4)猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白的抽提和纯化
[0023]a裂解剂筛选和细菌膜蛋白抽提
[0024] 将步骤（3)得到的菌体培养物融化，重悬于缓冲液1，用超声仪在冰浴中破碎细胞 壁，超声液100, 〇〇〇g、4-8°C离心1小时分离上清和沉淀，沉淀用溶解液溶解，加入裂解剂在 4°C搅拌2h抽提大肠杆菌膜蛋白，测定抽提物的活性，以确定总蛋白和裂解剂的比例，抽提 物以100, 000g超速离心1小时，获得可溶性上清，再用缓冲液1稀释至最终裂解剂浓度为 0.5-1.0% (w/v)以便于后续纯化；
[0025] 其中，所述的缓冲液1含有20mMNaH2P04，100mMNaCl，lyM蛋白酶抑制剂E-64、 0· 3mM三羧甲基磷酸，pH7. 5 ;
[0026] 所述的溶解液含有20mMTris-HCl，300mMNaCl，ImM2-巯基乙醇，pH8. 0;所述的 裂解剂为TritonX-100和十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM)的混合物，使用浓度5. 0-10% (w/v)；
[0027] b猪繁殖与呼吸综合征病毒MBP-M蛋白纯化
[0028] 在4°C条件下，20mL直链淀粉介质装柱、用3-5倍柱体积的平衡溶液1平衡，含猪 繁殖与呼吸综合征病毒MBP-M蛋白的上清液以2mL/min的速度进行虹吸上样，上样后用10 倍柱体积的平衡溶液1洗涤，再用3倍柱体积的不含EDTA的平衡溶液1洗涤，最后用10倍 柱体积的洗脱溶液洗脱，收集洗脱液，测定蛋白含量、纯度；
[0029] 其中，所述的平衡溶液1含有20mMTris-HCl，300mMNaCl，ImM2-巯基乙醇，ImM EDTA, 1. 0% (w/v)Triton-X100,pH8. 0 ；
[0030] 所述的洗脱溶液含有20mMTris-HCl，300mMNaCl，ImM2-巯基乙醇，lOmM麦芽糖， pH8· 0，；
[0031]c猪繁殖与呼吸综合征病毒MBP-M蛋白的酶切
[0032] 按75-100ug蛋白加入1单位的Xa因子进行常温反应36_48h，使酶切程度达到 90-95% ；
[0033]d镍离子亲和层析纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白
[0034] 10mLNi2+介质装住，用5倍柱体积的蒸馏水洗涤，用10倍柱体积的缓冲液2平衡， 步骤C得到的酶切反应液上样于层析柱，上样后用10倍柱体积的缓冲液2洗涤，最后用含 0. 25mmol咪唑的缓冲液2洗脱，收集镍离子柱洗脱液，纯度检测达90%以上；
[0035] 其中，所述的缓冲液2含有50mM磷酸钠，0. 3mMNaCl，pH8. 0,；
[0036]e抗麦芽糖抗体Sepharose4亲和层析纯化
[0037] 镍离子柱洗脱液和抗麦芽糖抗体偶联的Sepharose4亲和介质混合后，4°C孵育 18-24小时，吸附除去MBP，收集流穿液，流穿液室温4000rpm离心后收获上清液；
[0038] f凝胶层析纯化
[0039] 在步骤e得到的上清液中，加入TritonX-100使其终浓度为0.031 % (w/v)，用截 留值为50kDa的滤器离心浓缩至含5 - 10mg/mL蛋白，使用2500mLSuperdex20002/150柱 进行分子筛层析，浓缩蛋白注射上样，层析柱用平衡液2洗脱，分步收集洗脱液，收集液检 测纯度和含量，合并收集第