一峰洗脱液并用截留值为l〇〇kDa的超滤器透析浓缩，获得高度 纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白，纯度检测可达98. 0%以上；
[0040]其中，所述的平衡液 2 含有 10mMHEPES, 150mMNaCl, 0· 3mMTCEP, 0· 031% (w/v) TriotonX-100?pH7. 2〇
[0041] 在本发明中，优选的，步骤（1)中所述的RT-PCR法的引物序列为SEQIDN0:1和 SEQIDNO:2所示；步骤⑵中所述的引物的序列为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示； 步骤（3)中所述的大肠杆菌为B834-pRARE2;步骤（4)中所述的总蛋白和裂解剂的比例为 1:4(w/w)〇
[0042] 猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白在感染细胞和病毒颗粒中的含量少且高度疏水 性，普通制备困难，多采用基因工程方法制备，常采用真核系统进行表达，且其表达、抽提、 纯化的步骤多，收率低、成本费用昂贵。针对以上问题，本发明公开了一种制备猪繁殖与呼 吸综合征病毒全长Μ蛋白的方法。本发明采取原核表达系统，融合了提高疏水蛋白可溶性 表达、方便分离的纯化标签，对大肠杆菌膜蛋白抽提能力不同裂解剂进行筛选和组合，通过 大量融合表达、细菌破碎、细菌膜抽提、麦芽糖直链淀粉亲和层析、酶切除去融合伴侣反应， 镍离子亲和层析、抗麦芽糖抗体偶联的亲和层析纯化，最后采用分子筛层析，使猪繁殖与呼 吸综合征全长Μ蛋白纯度达98 %以上并具有生物活性（非包涵体形式不经变性、复性，可溶 性）。
[0043] 用发明公开的猪繁殖与呼吸病毒全长Μ的制备方法，20升的发酵罐发酵诱导培养 均可得4~6mg的Μ蛋白，纯度在98 %以上，可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒全长Μ蛋白的 亲和层析纯化的多克隆抗体制备。
[0044] 在本发明的一个具体实施例中，对表达细菌和裂解剂进行了筛选，结果发现：稀 有密码子补充的大肠杆菌E.coliB834-pRARE2.是大量表达制备、具有生物活性的全长 猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白Μ的最佳细菌，含MBP-M质粒转化稀有密码子补充菌 BL21 (DE3) -RILP并不能改善ΜΒΡ-Μ融合蛋白有活性高水平表达，另外的稀有密码子补充菌 株C41 (DE3)-pRARE2、C43 (DE3)-pRARE2 表达ΜΒΡ-Μ的水平与Ε.coliB834-pRARE2-样； TritonX-100和DDM的混合极大降低了总蛋白的抽提所需裂解剂的用量，降低了裂解剂对 Μ蛋白生物学、理化性质以及后处理的影响，改善了有活性的PRRSV膜蛋白的抽提和纯化。 后续2步亲和层析和分子筛凝胶层析纯化产生了高活性、高收率的猪繁殖与呼吸综合征病 毒膜蛋Μ，可用于细胞受体或病毒膜蛋白结构、功能以及病毒抗原、抗体诊断试剂、更重要的 是猪繁殖与呼吸高效、安全疫苗的研究。
[0045] 进一步的，本发明还提供了所述的免疫层析条在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病 毒抗体试剂中的应用。
[0046] 在本发明中，公开了PRRSV的保守蛋白Μ的可溶性大肠杆菌大量表达、高度纯化的 方法，并公开了以PRRSVΜ蛋白制备免疫层析条，对制备的免疫条检测试验性猪感染PRRSV的抗体和临床样本抗体进行了评估、验证。通过用商用标准间接ELISA和自家间接免疫荧 光法（IFA)双盲检测同一样本的结果比较，包括双盲重复检测模糊结果，表明这三种方法 都能检测PRRSV抗体。
[0047] 商用间接ELISA测定PRRSVN蛋白抗体作为感染阳性，本发明测定猪血清的Μ蛋 白抗体作为感染阳性。PRRSV感染的体液免疫动力学研究表明猪感染后细胞主要产生大量 产生N蛋白，血清主要为N蛋白抗体，常采用联合传统方法进行PRRSV诊断。近期的PRRSV 基因组学以及全序列测序表明，PRRSVΜ蛋白在美洲型和欧洲型PRRSV的基因组中高度保 守，且受到的突变压力小，是PRRSV广谱免疫的最佳候选抗原，因此PRRSVΜ蛋白的性质也 适合检测PRRSV感染。
[0048]目前PRRSV感染主要是根据临床症状、宏观损伤以及实验室病毒分离、ELISA、 RT-PCR、免疫组化确证综合方法进行诊断。快速、特异的现场PRRSV检测有足于早期假设诊 断、提前布防防止病毒扩散，更重要的是本发明的层析条和PRRSV抗体的金标准ELISA检测 的1080份样本，结果高度一致。见表2和表3,但有一些结果不一致，主要因为免疫层析条 的模糊不清的结果（最后判定为阴性）。标准ELISA检测，88%的样品S/P比在0. 35-0. 45 之间，接近标准的临界值。主要的是标准间接ELISA，采用PRRSVN蛋白为抗原，检测的血 清中N抗体，本发明采用间接ELISA，采用PRRSVΜ抗体为抗原，检测PRRSV感染血清中的Μ 蛋白抗体。也揭示了PRRSV感染的Μ蛋白抗体反应和Ν蛋白抗体动力学的一致性。为自主 PRRSV抗体胶体金试剂盒的创制打下深厚基础。
[0049] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0050] 猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白在欧洲型和美洲型PRRSV中高度保守且具有多 重免疫表位，本发明用大肠杆菌实现了全长Μ蛋白的可溶性高水平表达且高度纯化。用 PRRSVΜ蛋白制成层析条，具有猪PRRSV抗体筛选的简单灵敏特异性。除了快速、准确、特异 外，此法不需人员培训，检测费用低廉，每份样品检测费用不高于30元；另外在密封的包装 中不需冷链，有效稳定；不仅可检测自然感染的抗PRRSV抗体，而且可检测试验性感染的猪 血清，具有灵敏、特异、准确，特别是准确性为95%，该层析条可在简易条件操作不需复杂设 备，进一步可结合扫描仪，实现床旁检验（PointofCareTest)或及时（(Pen-side)检验。
【具体实施方式】
[0051] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0052] 实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)M膜蛋白基因克隆
[0053] 1. 1病毒和细胞培养
[0054]HP-PRRSV-JXM-F5毒株，为在MARC-145细胞上传至5代的适应株，猪繁殖与呼吸 综合征病毒，其保藏号是：CGMCCN0. 9453,已被公开，专利【申请号】201410842421. 9,专利名 称：一种广谱粘膜免疫防控猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其应用。属于美洲型（2 型）PRRSV病毒，其培养和滴定采用MARC-145细胞，培养基为DMEM培养基，含10 %灭活胎牛 血清、100μg/ml链霉素、100IU/ml青霉素，培养条件37°C，5%C02环境。
[0055] 1. 2PRRSVΜ蛋白RNA抽提和cDNA克隆
[0056]PRRSV病毒液280μ1加入1120μ1缓冲液AVL(QIAamp病毒RNA分离试剂盒， Qiagen)，在室温祸旋混合10分钟，加入1120μ1乙醇，反复颠倒几次，1分钟6000g离心使 病毒RNA吸附到旋转分离柱子上，用试剂盒中缓冲液AW洗涤，60μ1二乙基焦碳酸水洗脱。
[0057]SuperscriptIIRNaseΗ.sup.-reversetranscriptase(RT)逆转录酶 (LifeTechnologies，Inc.)、PRRSV随机引物、纯化病毒RNA67°C加热 7 分钟。40μ1 的反 应体系包括 5mMMgCl2、1X标准缓冲液II(PerkinElmerCorp.)，ImMdNTP、1 单位RNA酶 抑制剂、2单位逆转录酶、1μ1RNA，42°C15分钟、99°C5分钟、5°C5分钟孵育。
[0058] 多聚酶链25μ1反应混合物：10μ1cDNA产物、2mMMgCl2、1X标准缓冲液 II(PerkinElmerCorp.)，0.2mMdNTP、0.375 单位Taq酶、0·3μΜ5' 端引物MFl、0.3yM 3'端引物MR1，见表1。多聚酶链反应条件：95°C5分钟变性，进入30次循环反应，每次循 环95 °C变性30秒、50 °C退火30秒、72 °C延伸45秒，30个循环后产物72 °C延伸10分钟，置 于4°C。PCR产物纯化可用商用试剂盒按说明书进行。按表1所示的酶切位点分别酶切消 化质粒pGEM-T质粒、纯化的RT-PCR产物，连接获得pGEM-T-PRRSV-M质粒。
[0059] 表1PRRSVΜ蛋白基因扩增引物、酶切位点、产物
[0060]
[0061]pGEM-T-PRRSV-M质粒，经酶切获得537bp的片段，测序结果表明序列准确。
[0062] 实施例2猪繁殖与呼吸综合征病毒全长MBP-M蛋白可溶性、大量表达和抽提
[0063] 1. 1表达质粒构建和筛选
[0064] 大肠杆菌可溶性表达质粒的PRRSVΜ蛋白构建和筛选；以pGEM-T-PRRSV-M质粒 为模板，设计引物合成带有组氨酸标签的猪繁殖与呼吸综合征病毒Μ蛋白cDNA序列，在上 游引物的3'端引入BamHI酶切位点，在下游引物的3'端引入HindIII酶切位点及6个组氨 酸纯化标签序列，引物MF2:5' -GGATCCCCCACGGCCACTGCTA-3'，引物MR2:5'-AAGCTTTTATTT GGCΑΤΑTTTGACAAGCACACCACCACCACCACCAC-3'，产物与用同样酶切后的表达质粒片段连 接，所选表达质粒为pMAL-c2X或pMAL-p2X。
[0065] 1.2表达细菌的筛选
[0066]构建的MBP-M不同表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)、B834-pRARE2、 BL21 (DE3)-RILP、C41 (DE3)-pRARE2、C43(DE3)-pRARE2。其中，BL21 (DE3)、B834-pRARE2 活化细胞购自德国Novagen公司，BL21(DE3)-RILP购自美国Stratagene公司， C41 (DE3) -pRARE2、C43 (DE3) -pRARE2 购自Lucigen公司。稀有密码子补充质粒pRARE2 来 自大肠杆菌Rosetta2在应用中转入适当细菌增强表达（购自Novagen公司），培养基加 入100μg/mL氨苄青霉素，在培养含稀有密码子增强表达质粒（pRARE2,RILP)转化菌中按 34μg/mL加入氯霉素。细菌种子用3mLLB培养基37°C培养至0D600达0. 5-0. 6时，接种到 100mL的LB培养基中；25°C过夜摇动培养，接种1L有LB培养基37°C培养至0D600为0. 7 时，加入0. 7mMIPTG在37°C培养4-6小时，离心收集细菌，-80°c保存。取0.lg细菌作为 样品进行电泳分析。
[0067] 1. 3裂解剂溶解、优化和筛选
[0068] 0·2g细菌沉淀物重悬35mL缓冲液1 (20mMNaH2P04,lOOmMNaCl, 1μΜ蛋白酶抑制 剂E-64、0. 3mM三羧甲基磷酸（TCEP)，ρΗ7. 5)，在冰浴上超声15分钟，超声2s，停顿2s，输 出设置为7,超声仪Misonix3000。超声液10