彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 在免疫层析检测领域，目前有两种主流的检测方式：一种是通过肉眼判读的定性 检测免疫层析试纸条，包括胶体金标记试纸条、彩色乳胶标记试纸条等，其优点是无需配置 任何检测设备即可对样品中待测物的含量做出定性的判断，缺点是无法定量，不能提供准 确的浓度数据，且其检测灵敏度偏低，一般只能检出浓度在ng/ml级别以上的待测物；另一 种是通过仪器判读的荧光免疫层析试纸条，其优点是通过仪器判读数据，可提供准确的浓 度数据，且检测灵敏度比胶体金或彩色乳胶标记的试纸条要高2-3个数量级，但其缺点是 在没有读数仪的情况下完全无法获得待测物的含量浓度情况。
【发明内容】
[0003] 本发明主要提供了一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法，其检测 结果既可通过肉眼进行阴阳性初步定性判断，又可通过仪器分析，获得准确的检测数据。
[0004] -种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，包括底板，底板的一面上顺序设有添加 待测样品的加样垫、标记物结合垫、设有检测线T线和质控线C线的检测垫和提供毛细管虹 吸动力的吸水垫，相邻各垫依次搭接，标记物结合垫上涂覆有彩色-荧光双功能微球标记 物探针。
[0005] 优选的，所述彩色-荧光双功能微球标记物探针含有待测物抗体彩色-荧光双功 能微球标记物和兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光双功能 微球标记物，待测物抗体彩色-荧光微球标记物由与待测物相关的抗原抗体或配体受体和 彩色-荧光双功能微球结合制备而成，兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原 抗体彩色-荧光双功能微球标记物由兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗 体和彩色-荧光双功能微球结合制备而成。
[0006] 优选的，所述检测线T线包被有与待测物相关的抗原抗体或配体受体，质控线C线 包被有与待测物无关的抗原抗体或配体受体。
[0007] 优选的，所述彩色-荧光双功能微球的粒径为50-1000nm，彩色-荧光双功能微 球的材质为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乙烯吡啶微球、聚乙基丙烯酸甲酯微 球、脂质微球和二氧化硅微球中的一种，所述彩色-荧光双功能微球表面带有羧基、氨基、 醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基和环氧基中的一种或多种或不带基团。
[0008] 优选的，所述彩色-荧光双功能微球的颜色为红色、蓝色、绿色、紫色和黑色中的 一种肉眼可见的深色；荧光是稀土螯合物荧光、量子点荧光和普通荧光中的一种；颜色发 射的波长和焚光物质发射的波长差大于等于30nm。
[0009] 优选的，所述加样垫为具有过滤作用的材质，加样垫的材质为玻璃纤维、聚酯膜、 海绵、滤纸或经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的 磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理后的玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸；
[0010] 优选的，所述标记物结合垫的材质为玻璃纤维、聚酯膜或经过添加有表面活性剂、 糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷盐酸 盐（Tris-HCl缓冲液）浸泡预处理后的玻璃纤维或聚酯膜；
[0011] 优选的，所述检测垫为具有强疏水特性的多孔材料，检测垫的材质为硝酸纤维素 膜或醋酸纤维素膜，T线和C线至少为一条。
[0012] -种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0013] (I)加样垫的制备
[0014] 用含有乙二胺四乙酸（EDTA)、吐温20 (tween-20)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)和牛血 清白蛋白（BSA)的磷酸缓冲液（PBS缓冲液）浸泡玻璃纤维、聚酯膜、海绵或滤纸，然后置于 烘箱中烘干，密封干燥保存备用；
[0015] (II)标记物结合垫的制备
[0016] 用含有海藻糖、牛血清白蛋白、tween-20和PVP的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维或聚 酯膜，然后置于烘箱中烘干，再将彩色-荧光双功能微球标记物探针喷涂于处理烘干后的 玻璃纤维或聚酯膜上，再次置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用；
[0017] (III)检测垫的制备
[0018] 检测线T线的包被：将与待测物相关的抗原抗体或配体受体与用含有海藻糖和 十二烷基硫酸钠（SDS)的PBS缓冲液溶解，制得喷涂液一，将喷涂液一喷涂在距检测垫左端 12mm处形成检测线T线；
[0019] 质控线C线的包被：将与待测物无关的抗原抗体或配体受体用含有海藻糖和SDS 的磷酸缓冲液溶解，制得喷涂液二，将喷涂液二喷涂在距检测垫左端18_处形成检测线T 线；
[0020] 将喷涂好的检测垫干燥保存备用；
[0021] (IV)试纸条的组装
[0022] 在聚氯乙烯（PVC)底板上依次搭接处理过的加样垫、喷有彩色-荧光双功能微球 标记物探针的标记物结合垫、喷涂有检测线T线和质控线C线的检测垫以及吸水垫，组装完 毕后剪切成4_宽的试纸条即可。
[0023] 优选的，步骤（II)中所述彩色-荧光双功能微球标记物探针具体制备方法如下：
[0024] (b)彩色-荧光双功能微球的制备：在去离子水中加入二氯甲烷或四氢呋喃和步 骤（a)制备完成的微球，得微球溶液，将溶于二氯甲烷或四氢呋喃的荧光标记物和脂溶性 彩色颜料逐滴加入微球溶液中并密封搅拌均匀，然后解除密封并去除二氯甲烷或四氢呋 喃，最后离心处理，得到彩色-荧光双功能微球，备用；
[0025] (c)待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物的制备：用缓冲液稀释步骤（b)制 备完成的彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，于摇床上活化后， 离心处理，去除上清液，加入缓冲液对沉淀复溶，然后加入与待测物相关的抗原抗体或配体 受体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清 液，再用缓冲液对沉淀复溶，超声处理，制得待测物抗体彩色-荧光微球标记物；
[0026] (d)兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记 物的制备：用缓冲液稀释彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和兔、鼠或其他与待测物 抗原抗体无交叉反应的抗原抗体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过 夜，最后离心处理，去除上清液，再用缓冲液复溶，超声处理，制得兔、鼠或其他与待测物抗 原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物；
[0027] (e)彩色-荧光双功能微球标记物探针的制备：待测物抗体彩色-荧光微球标记 物与兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物按一定 比例混合，喷于结合垫上制得彩色-荧光双功能微球标记物探针。
[0028] 采用上述彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，本发明具有以下优点：
[0029] 本发明制备的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条既可以通过肉眼对检测结果进 行阴阳性初步定性判断，在不需要专业检测仪器时，对样品中待测物的含量作出定性判断， 检测灵敏度高，可以定性检测ng/ml级别以下的待测物；又可通过仪器对结果进行定量分 析，获得准确的浓度数据，且检测灵敏度比现有的胶体金或彩色乳胶标记的试纸条要高2-3 个数量级，检测精度高，满足了不同检测项目、环境、目的、灵敏度要求情况下多样的检测需 求。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的结构示意图。
[0031] 其中：1、底板，2、加样垫，3、标记物结合垫，4、检测垫，41、检测线T线，42、质控线C 线，5、吸水垫。
【具体实施方式】
[0032] -种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，包括底板1，底板1的一面上顺序设有添 加待测样品的加样垫2、标记物结合垫3、设有检测线T线41和质控线C线42的检测垫4 和提供毛细管虹吸动力的吸水垫5,相邻各垫依次搭接，标记物结合垫3上涂覆有彩色-荧 光双功能微球标记物探针。
[0033] 彩色-荧光双功能微球标记物探针含有待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记 物和兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光双功能微球标记 物，待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物由与待测物相关的抗原抗体或配体受体和彩 色-荧光双功能微球结合制备而成，兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应抗原抗体 彩色-荧光双功能微球标记物由兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体和 彩色-荧光双功能微球结合制备而成。
[0034] 检测线T线41包被有与待测物相关的抗原抗体或配体受体，质控线C线42包被 有与待测物无关的抗原抗体或配体受体。
[0035] 待检测物可以是生物毒素及其代谢物、小分子化学物质及大分子蛋白、核酸等，均 可使用本发明的试纸条检测。以下具体实施例中以黄曲霉毒素Ml和氯霉素为例，示意性说 明本发明的试纸条具有彩色-荧光双功能。检测其他物质时，与实施例中操作类似，做简单 替换即可。
[0036] 所述生物毒素为黄曲霉毒素Ml时，彩色-荧光双功能微球标记物探针含有黄曲霉 毒素Ml抗体彩色-荧光双功能微球标记物和兔IgG彩色-荧光微球标记物。检测线T线 41包被有黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物，质控线C线42包被有羊抗兔多克隆抗体。
[0037] 所述小分子化学物质为氯霉素时，彩色-荧光双功能微球标记物探针含有氯霉素 抗体彩色-荧光双功能微球标记物和鸡IgG彩色-荧光微球标记物。检测线T线41包被 有氯霉素-牛血清白蛋白偶联物，质控线C线42包被有羊抗鸡多克隆抗体。
[0038] 所述彩色-荧光双功能微球的粒径为50-1000nm，彩色-荧光双功能微球的材质为 聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乙烯吡啶微球、聚乙基丙烯酸甲酯微球、脂质微 球和二氧化硅微球中的一种，所述彩色-荧光双功能微球表面带有羧基、氨基、醛基、溴乙 酰基、碘乙酰基、硫醇基和环氧基中的一种或多种或不带基团。
[0039] 所述彩色-荧光双功能微球的颜色为红色、蓝色、绿色、紫色和黑色中的一种肉眼 可见的深色；荧光是稀土螯合物荧光、量子点荧光和普通荧光中的一种；颜色发射的波长 和焚光