C背衬上依次搭接并粘贴。
[0125] 将本实施例处理过的加样垫2、喷有氯霉素抗体红色-罗丹明荧光双功能微球标 记物探针的标记物结合垫3、喷涂有检测线T线41和质控线C线42的检测垫4以及吸水 垫5组装完毕后剪切成4_宽的试纸条，装入塑料卡壳中，然后装入内置有干燥剂的铝箱袋 中，室温干燥保存即可，保质期可达两年以上。
[0126] 若将上述试纸条固定于具有加样孔和检测窗口的塑料卡壳中，贝制成检测卡。
[0127] 二、荧光定量标准曲线的确定
[0128] 将氯霉素标准品用生乳稀释到 0ng/mL、0. 025ng/mL、0. 05ng/mL、0.lng/mL、0. 3ng/ mL、0. 5ng/mL、l.Ong/mL，按照标准操作流程每种毒素每个浓度检测10次，然后将所测得的 数值输入Microdetection食品安全管理软件（南京微测生物科技有限公司）中，即可获得 标准曲线的各个参数，然后将标准曲线的参数、产品批号等信息录入1C卡中即可。
[0129] 三、待测样品检测
[0130] 1.检测方法
[0131 ] 将制备完成的氯霉素红色-罗丹明荧光双功能免疫层析试纸条平放于桌面上，取 100μL待测奶样（20-30°C)，滴加至试纸条的加样垫2处，计时5分钟，观察检测结果。
[0132] 2.结果判定
[0133] ①肉眼判读
[0134] 当检测试纸条的T线肉眼不可见，C线肉眼可见时，说明奶样中氯霉素的浓度高于 0.lng/ml;当检测试纸条的T线肉眼可见，C线肉眼可见时，说明奶样中氯霉素的浓度低于 0.lng/ml;当C先肉眼不可见，不管T线是否肉眼可见，均判为无效，需重新检测。
[0135] ②荧光读数仪判读
[0136] 将检测试纸条插入荧光读数仪中，按读数键即可进行读数和自动计算，氯霉素的 浓度可通过液晶屏显示，也可通过读数仪自带的热敏打印机现场打印，还可通过仪器上 GPRS和WIFI无线通信模块将检测数据实时发送到云端数据管理平台，实现对检测结果的 实时监控。
[0137] 3.试纸条检测结果准确性判定
[0138] 向经高效液相色谱质谱联用仪检测氯霉素含量为0的鲜牛奶中添加氯霉素标准 品溶液，使其浓度分别达到 0ng/mL、0. 025ng/mL、0. 05ng/mL、0.lng/mL、0. 3ng/mL、0. 5ng/mL，1.Ong/mL，分别检测本实施例制备完成的试纸条的准确性，重复以上检测实验10次，取 仪器判读结果的平均值。
[0139] 检测实验结果如下表2所示。
[0140] 表2检测试验结果2
[0141]
[0143] 本实施例制备完成的红色-罗丹明荧光微球双功能检测试纸条在使用时，既可肉 眼判断奶样中氯霉素的量是否超过〇.lng/ml，进行初步定性判断，得知奶样是否为合格牛 奶；也可通过荧光读数仪获得准确的定量检测结果，很好的满足了多样的检测需求。
[0144] 对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种 相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围 之内。
【主权项】
1. 一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板（1)，底板（1)的一 面上顺序设有添加待测样品的加样垫（2)、标记物结合垫（3)、设有检测线T线（41)和质控 线C线（42)的检测垫（4)和提供毛细管虹吸动力的吸水垫（5)，相邻各垫依次搭接，标记物 结合垫（3)上涂覆有彩色-荧光双功能微球标记物探针。2. 根据权利要求1所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：彩色-荧光 双功能微球标记物探针含有待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物和兔、鼠或其他与待 测物抗原抗体无交叉反应的IgG彩色-荧光双功能微球标记物，待测物抗体彩色-荧光微 球标记物由与待测物相关的抗原抗体或配体受体和彩色-荧光双功能微球结合制备而成， 兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的IgG彩色-荧光微球标记物由兔、鼠或其他与 待测物抗原抗体无交叉反应的IgG和彩色-荧光双功能微球结合制备而成。3. 根据权利要求2所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：检测线T 线（41)包被有与待测物相关的抗原的抗体或配体受体，质控线C线（42)包被有与待测物 相关的抗原的抗体或配体受体或包被有与待测物无关的抗原的抗体或配体受体。4. 根据权利要求2所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：所述彩 色-荧光双功能微球的粒径为50-1000nm，彩色-荧光双功能微球的材质为聚苯乙烯微球、 聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乙烯吡啶微球、聚乙基丙烯酸甲酯微球、脂质微球和二氧化硅微 球中的一种，所述彩色-荧光双功能微球表面带有羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、 硫醇基和环氧基中的一种或多种或不带基团。5. 根据权利要求2-4任一项所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于： 所述彩色-荧光双功能微球的颜色为红色、蓝色、绿色、紫色和黑色中的一种肉眼可见的深 色；荧光是稀土螯合物荧光、量子点荧光和普通荧光中的一种；颜色发射的波长和荧光物 质发射的波长差大于等于30nm。6. 根据权利要求5所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：加样垫（2) 为具有过滤作用的材质，加样垫（2)的材质为玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸或经过添加有 表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或Tris-HCl 缓冲液浸泡预处理后的玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸； 标记物结合垫（3)的材质为玻璃纤维、聚酯膜或经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白 类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理后的 玻璃纤维或聚酯膜； 检测垫（4)为具有强疏水特性的多孔材料，检测垫（4)的材质为硝酸纤维素膜或醋酸 纤维素膜，检测线T线（41)和质控线C线（42)至少为一条。7. -种权利要求6的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包 括以下步骤： (I)加样垫⑵的制备 用含有EDTA、tween-20、PVP和BSA的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维、聚酯膜、海绵或滤纸， 然后置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用； (II)标记物结合垫（3)的制备 用含有海藻糖、牛血清白蛋白、tween-20和PVP的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维或聚酯膜， 然后置于烘箱中烘干，再将彩色-荧光双功能微球标记物探针喷涂于处理烘干后的玻璃纤 维或聚酯膜上，再次置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用； (III)检测垫⑷的制备 检测线T线（41)的包被：将与待测物相关的抗原抗体或配体受体用含有海藻糖和SDS的PBS缓冲液溶解，制得喷涂液一，将喷涂液一喷涂在距检测垫（4)左端12mm处形成检测 线T线（41); 质控线C线（42)的包被：将与待测物无关的抗原抗体或配体受体用含有海藻糖和SDS的磷酸缓冲液溶解，制得喷涂液二，将喷涂液二喷涂在距检测垫（4)左端18mm处形成质控 线C线（42); 将喷涂好的检测垫（4)干燥保存备用； (IV)试纸条的组装 在PVC底板（1)上依次搭接处理过的加样垫（2)、喷有彩色-荧光双功能微球标记物探 针的标记物结合垫（3)、喷涂有检测线T线（41)和质控线C线（42)的检测垫（4)以及吸水 垫（5)，组装完毕后剪切成4_宽的试纸条即可。8.根据权利要求7所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于： 步骤（II)中所述彩色-荧光双功能微球标记物探针具体制备方法如下： (a) 微球的制备：采用微乳聚合法制备粒径为50-1000nm的聚苯乙烯微球、聚甲基丙 烯酸甲酯微球、聚乙烯吡啶微球、聚乙基丙烯酸甲酯微球、脂质微球和二氧化硅微球中的一 种，所述微球表面带有羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基和环氧基中的一种或 多种或不带基团； (b) 彩色-荧光双功能微球的制备：在去离子水中加入二氯甲烷或四氢呋喃和步骤（a) 制备完成的微球，得微球溶液，将溶于二氯甲烷或四氢呋喃的荧光标记物和脂溶性彩色颜 料逐滴加入微球溶液中并密封搅拌均匀，然后解除密封并去除二氯甲烷或四氢呋喃，最后 离心处理，得到彩色-荧光双功能微球，备用； (c) 待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物的制备：用缓冲液稀释步骤（b)制备完 成的彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，于摇床上活化后，离心处 理，去除上清液，加入缓冲液对沉淀复溶，然后加入与待测物相关的抗原抗体或配体受体， 于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清液，再 用缓冲液对沉淀复溶，超声处理，制得待测物抗体彩色-荧光微球标记物； (d) 兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物的 制备：用缓冲液稀释彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和兔、鼠或其他与待测物抗原抗 体无交叉反应的抗原抗体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最 后离心处理，去除上清液，再用缓冲液复溶，超声处理，制得兔、鼠或其他与待测物抗原抗体 无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物； (e) 彩色-荧光双功能微球标记物探针的制备：待测物抗体彩色-荧光微球标记物与 兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物按一定比例 混合，喷于结合垫上制得彩色-荧光双功能微球标记物探针。
【专利摘要】本发明属于生物检测领域，具体涉及一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法，包括底板(1)，底板(1)的一面上顺序设有添加待测样品的加样垫(2)、标记物结合垫(3)、设有检测线T线(41)和质控线C线(42)的检测垫(4)和提供毛细管虹吸动力的吸水垫(5)，相邻各垫依次搭接，标记物结合垫(3)上涂覆有彩色-荧光双功能微球标记物探针。本发明的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法，其检测结果既可通过肉眼进行阴阳性初步定性判断，又可通过仪器分析，获得准确的检测数据。
【IPC分类】G01N33/558
【公开号】CN105424923
【申请号】CN201510576098
【发明人】肖理文, 徐秀, 曹建伟
【申请人】南京微测生物科技有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年9月10日