将羊抗兔IgG单克隆抗体用含有1. 5% (m/v)的海藻糖和0· 05% (v/v)的SDS的 浓度为〇. 01mol/L、pH7. 4的磷酸缓冲液溶解至终浓度1.Omg/mL，将上述混合液用喷膜机喷 涂在距硝酸纤维素膜左端18mm处形成质控线C线42。将喷涂好的硝酸纤维素膜在37°C条 件下烘干2小时，置于室温干燥环境中保存备用。
[0082] (IV)试纸条的组装
[0083] 如图1所示，所述彩色-荧光双功能免疫层析试纸条包括底板1，底板1的一面上 顺序设有添加待测样品的加样垫2、标记物结合垫3、设有检测线T线41和质控线C线42 的检测垫4和提供毛细管虹吸动力的吸水垫5,相邻各垫在PVC背衬上依次搭接并粘贴。
[0084] 将本实施例处理过的加样垫2、喷有黄曲霉毒素Ml抗体蓝色-荧光双功能微球标 记物探针的标记物结合垫3、喷涂有检测线T线41和质控线C线42的检测垫4以及吸水 垫5组装完毕后剪切成4_宽的试纸条，装入塑料卡壳中，然后装入内置有干燥剂的铝箱袋 中，室温干燥保存即可，保质期可达两年以上。
[0085] 若将上述试纸条固定于具有加样孔和检测窗口的塑料卡壳中，则制成检测卡。
[0086] 二、荧光定量标准曲线的确定
[0087] 将黄曲霉毒素Ml标准品用生乳稀释到0ng/mL、0. 025ng/mL、0. 075ng/mL、0. 3ng/ mL、0. 9ng/mL、2. 7ng/mL、8.Ing/mL，按照标准操作流程每种毒素每个浓度检测10次，然后 将所测得的数值输入Microdetection食品安全管理软件（南京微测生物科技有限公司） 中，即可获得标准曲线的各个参数，然后将标准曲线的参数、产品批号等信息录入1C卡中 即可。
[0088] 二、待测样品检测
[0089] L检测方法
[0090] 将制备完成的黄曲霉毒素Ml蓝色-荧光双功能免疫层析试纸条平放于桌面上，取 100μL待测奶样（20-30°C)，滴加至试纸条的加样垫2处，计时5分钟，观察检测结果。
[0091] 2.结果判定
[0092] ①肉眼判读
[0093] 当检测试纸条的T线肉眼不可见，C线肉眼可见时，说明奶样中黄曲霉毒素Ml的 浓度高于〇. 3ng/ml;当检测试纸条的T线肉眼可见，C线肉眼可见时，说明奶样中黄曲霉毒 素Ml的浓度低于0. 3ng/ml;当C先肉眼不可见，不管T线是否肉眼可见，均判为无效，需重 新检测。
[0094] ②荧光读数仪判读
[0095] 将检测试纸条插入荧光读数仪中，按读数键即可进行读数和自动计算，黄曲霉毒 素Ml的浓度可通过液晶屏显示，也可通过读数仪自带的热敏打印机现场打印，还可通过仪 器上GPRS和WIFI无线通信模块将检测数据实时发送到云端数据管理平台，实现对检测结 果的实时监控。
[0096] 3.试纸条检测结果准确性判定
[0097]向经高效液相色谱质谱联用仪检测黄曲霉毒素Ml含量为0的鲜牛奶中添加黄 曲霉毒素Ml标准品溶液，使其浓度分别达到0ng/mL、0. 025ng/mL、0. 075ng/mL、0. 3ng/mL、 0. 9ng/mL、2. 7ng/mL，8.Ing/mL，分别检测本实施例制备完成的试纸条的准确性。重复以上 检测实验10次，取仪器判读结果的平均值。
[0098] 检测实验结果如下表1所示。
[0099] 表1检测试验结果1
[0100]
[0101]测试结果表明：本实施例制备完成的蓝色-荧光微球双功能检测试纸条在使用 时，既可肉眼判断奶样中黄曲霉毒素Ml的量是否超过0. 3ng/ml，进行初步定性判读，得知 奶样是否为合格牛奶；也可通过荧光读数仪获得准确的定量检测结果，很好的满足了多样 的检测需求。
[0102] 实施例2
[0103] 氯霉素红色-罗丹明荧光双功能免疫层析试纸条
[0104] -、试纸条的制备方法
[0105] (a)微球的合成
[0106] 取8mmol的苯乙稀单体0.8mmol的丙稀酸单体溶解于10ml含0.3mmol的十二烧 基磺酸钠的去离子水中，将混合液加入圆底烧瓶中，用磁力搅拌子搅拌均匀。然后用高纯氮 气将圆底烧瓶中空气除尽，密封加热至70°C，加入0. 3ml0. 2mmol的过硫酸钾，密封隔氧搅 拌反应8h后，降至室温。然后将反应液用孔径为8μm的滤纸过滤，收集滤液离心纯化，离 心条件为50000g10°C恒温离心15min，去除上清液，用5ml去离子水复溶沉淀，反复洗涤三 遍，最后加入浓度为0. 05%的十二烷基磺酸钠和浓度为0. 05%的叠氮化钠于4°C保存。通 过调节加入丙烯酸的单体的量即可得到微球表面不同的羧基密度；通过调节十二烷基磺酸 钠和过硫酸钾的量，即可制备不同粒径的微球。
[0107] (b)红色-罗丹明荧光双功能微球的制备
[0108] 取1ml固含量为10%的上述制备完成的微球，加入9ml去离子水中，再加入3. 5ml 四氢呋喃，置于室温环境中，磁力搅拌30min，得预处理微球溶液。取3mg罗丹明B和5mg分 散红SER，溶于2ml四氢呋喃中，然后将上述溶液逐滴加入预处理微球溶液中，磁力搅拌条 件下室温保持5h。然后打开密封盖子，旋转真空条件下使溶液体系中的四氢呋喃挥发干净。 将溶液转入离心管中，离心洗涤三次，离心条件为：50000g10°C恒温离心15min。去上清， 前两次离心得的沉淀用50%的乙醇复溶，最后一次离心得的沉淀用10mlpH8. 0的0. 05M硼 酸缓冲液复溶，再加入浓度为〇. 05%的十二烷基磺酸钠和浓度为0. 05%的叠氮化钠4°C保 存。
[0109] (c)氯霉素抗体红色-罗丹明荧光微球标记物的制备
[0110] 取固含量为1%的上述红色-罗丹明荧光双功能微球l〇〇yL稀释于浓度为 0· 05mol/L、ρΗ8· 0的400μL硼酸缓冲液中，加入30μL浓度为10mg/mL的碳二亚胺（EDC) (购自上海晶纯生化科技股份有限公司）和60μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)(购自上海晶纯生化科技股份有限公司），将上述混合液室温条件下置于旋转摇床 上在50转/分钟条件下活化15min，然后40000g离心lOmin，去除上清液，用0. 05mol/L、 pH8. 0的硼酸缓冲液复溶沉淀，然后80W超声处理30S，加入20μg氯霉素鼠单抗（购自上 海飞测生物科技有限公司），室温置于旋转摇床上50转/分钟偶联2小时，加入50mmol/L 的乙醇胺（购自上海晶纯生化科技股份有限公司）、10 %的BSA(购自上海西宝生物科技有 限公司）溶液50μL封闭过夜。最后40000g离心10min，用0. 05mol/L、pH8. 0的硼酸缓冲 液复溶沉淀，反复洗涤2~3次，然后80W超声处理30S，置于4~8°C冰箱中保存备用。
[0111] (d)兔IgG红色-罗丹明荧光微球标记物的制备
[0112] 取固含量为1%的上述红色-罗丹明荧光双功能微球100yL稀释于0. 05mol/L、 pH8. 0的400μL硼酸缓冲液中，加入30μL10mg/mL的碳二亚胺（EDC)(购自上海晶纯生 化科技股份有限公司），再加入100μg兔IgG(购自长沙博优生物科技有限公司），将上述 混合液室温条件下置于旋转摇床上50转/分钟偶联2小时，加入50mmol/L的乙醇胺（购 自上海晶纯生化科技股份有限公司）、10 %的BSA(购自上海西宝生物科技有限公司）溶液 50μL封闭过夜。最后40000g离心10分钟，用0. 05mol/LpH8. 0的硼酸缓冲液复溶沉淀， 反复洗涤2~3次，然后80W超声处理30S，置于4~8°C冰箱中保存备用。
[0113] (e)试纸条的制备
[0114] (I)加样垫2的制备
[0115] 用含有 10mmol/L的EDTA、1% (v/v)的tween-20、0. 5% (m/v)的PVP、0. 5% (m/ v)的BSA的PBS缓冲液（0. 2mol/L，pH8. 0)浸泡玻璃纤维素膜加样垫，然后置于37°C烘箱 中烘烤2小时至完全干燥，置于密封干燥包装袋中保存备用。
[0116] (II)标记物结合垫3的制备
[0117] 首先用含有2. 5 % (m/v)的海藻糖、1 % (m/v)的牛血清白蛋白、1 % (v/v)的 tween-20、0. 5% (m/v)的PVP的0·lmol/LρΗ7· 4的磷酸缓冲液浸泡结合垫Fusion5 (购自 GE公司），然后置于37°C烘箱中烘干2小时。再将上述制备完成的氯霉素抗体红色-罗丹 明荧光微球标记物和兔IgG红色-罗丹明荧光微球标记物用0.lmol/L、pH7. 4的磷酸缓冲 液分别稀释400倍和1000倍后混合成氯霉素抗体红色-罗丹明荧光双功能微球标记物探 针，将上述探针用喷金仪喷于处理烘干后的Fusion5上，置于37°C烘箱中烘干2小时后，置 于密封干燥包装袋中保存备用。
[0118] (III)检测垫4的制备
[0119] 检测线T线41的包被
[0120] 将氯霉素与牛血清白蛋白偶联物（购自上海飞测生物科技有限公司）用含有 1. 5% (m/v)的海藻糖和0. 05% (v/v)SDS的浓度为0.Olmol/L、pH7. 4的磷酸缓冲液溶解 至终浓度为0. 〇25mg/mL，将上述混合液用喷膜机喷涂在距硝酸纤维素膜左端12mm处形成 检测线T线41。
[0121] 质控线C线42的包被
[0122] 将羊抗兔IgG单克隆抗体用含有1. 5% (m/v)的海藻糖和0. 05% (v/v)的SDS的 浓度为〇. 01mol/L、pH7. 4的磷酸缓冲液溶解至终浓度1.Omg/mL，将上述混合液用喷膜机喷 涂在距硝酸纤维素膜左端18mm处形成质控线C线42。将喷涂好的硝酸纤维素膜在37°C条 件下烘干2小时，置于室温干燥环境中保存备用。
[0123] (IV)试纸条的组装
[0124] 如图1所示，所述彩色-荧光双功能免疫层析试纸条包括底板1，底板1的一面上 顺序设有添加待测样品的加样垫2、标记物结合垫3、设有检测线T线41和质控线C线42 的检测垫4和提供毛细管虹吸动力的吸水垫5,相邻各垫在PV